Лабораторная работа № 20. Выделение изолированных протопластов

Изолированный протопласт представляет собой содержимое растительной клетки, окруженное плазмалеммой. Целлюлозная стенка у него отсутствует.

Изолированные протопласты одни из наиболее ценных объектов в биотехнологии. При их слиянии происходит образование гибридных клеток. В изолированные протопласты достаточно легко вводить генетическую информацию из органелл и клеток других растений, прокариотических организмов и из клеток животных, что имеет важное значение как в теоретическом, так и практическом отношении.

Цель работы: получить изолированные протопласты механическим методом.

Оборудование и материалы: 1 М раствор сахарозы, дистиллированная вода, пробирки, штативы для пробирок, пипетки на 10 мл, стерильные препаровальные иглы, лезвия, стеклянные палочки, предметные и покровные стекла, фильтровальная бумага.

Объект исследования: кусочки растительных тканей (окрашенная эпидерма чешуи лука, листьев бегонии или традесканции).

Ход работы.

Приготовить в пробирках растворы сахарозы в концентрациях 0,3; 0,35; 0,4; 0,45; 0,5; 0,55; 0,6; 0,7 М. Опустить в пробирки с растворами кусочки растительных тканей (окрашенная эпидерма чешуи лука, листьев бегонии или традесканции), что приводит к плазмолизу, позволяющему видеть протопласт в целой клетке. Через 10—15 мин извлечь растительную ткань из пробирок и положить на предметные стекла в каплю соответствующего раствора. Придерживая стеклянной палочкой, разрезать ее на тонкие полоски, оставляя неразрезанным общий конец. Осторожно провести препаровальной иглой по ткани, выдавливая в раствор содержимое разрушенных клеток. Убрать ткань, каплю раствора накрыть покровным стеклом, рассмотреть препарат в микроскоп с целью обнаружения изолированных протопластов.

Задание. Отметить раствор, в котором обнаружены изолированные протопласты, и зарисовать их. Сделать выводы.

Примечание. Механический метод извлечения изолированных протопластов дает очень небольшой выход целых протопластов. Он требует большой аккуратности и высокой точности исполнения. Растворы сахарозы разной концентрации позволяют выбрать один раствор, водный потенциал которого будет близок к водному потенциалу клеток растительной ткани. В этом растворе с наибольшей вероятностью будут сохраняться целые протопласты.