Изменения электронотранспортной функции митохондрий печени при геморрагическом шоке и их коррекция

Актуальность проблемы. Кровопотеря и геморрагический шокпатологические процессы, имеицие значительный удельный вес в клинической патологии. Установлено, что только в акушерской практике предродовые кровотечения отмечаются у 3% беременных женщин (Е.?.Аъаи1-каг1т, Е.н.сьеуЦ, 1974), а. геморрагический шок, как причина смерти, хотя стоит на четвертом месте после других видов шока, но по частоте занимает одно из первых мест и в большом числе случаев является осложнением других видов шока (Г.А.Рябов, 1974).

Несмотря на значительные успехи в организации скорой помощи и все расширяющийся арсенал профилактических и лечебных средств, шок по данным разных авторов, от 10 до 80 $ (Г.С.Левин, Ц.Л.Каме-нецкая, 1982), переходит в необратимую стадию. По установившемуся мнению, необратимость является относительным понятием, во многом обусловленным ограниченностью наших знаний о конкретных механизмах нарушений функций организма и отсутствием пока патогенетических средств и методов лечения (Г.Ш.Васадзе с соавт., 1973; С. А. Селезнев, 1973; В. К. Кулапин, 1974; Г. С. Левин с соавт., 1978 и др.). Из многих гипотез и теорий патогенеза необратимости при шоке все большее число сторонников в последние годы завоевывает гипотеза о главенствующей роли энергетического дефицита в развитии необратимой стадии шока.

В связи с этим особую актуальность приобретают исследования, направленные на изучение механизмов выработки и утилизации энергии в клетке на разных стадиях шока. Установление причин и характера нарушений функционирования энергетического механизма клеток жизненно важных органов, в частности печени, может способствовать разработке новых подходов к лечению разных стадий шока, прежде всего необратимой стадии.

В литературе нет единого мнения о характере изменений мито-ховдриального окисления в печени при геморрагическом шоке и почти отсутствуют исследования, направленные на изучение механизмов возникающих сдвигов. Известно, что в патологии состояние биохимических процессов складывается из реакций, отражающих повреждение, и проявлений компенсации и адаптации к измененным условиям. Современные возможности биохимии, в сочетании с исследованием характера течения патологического процесса, позволяют установить не только степень изменений, но и роль выявляемых сдвигов в механизмах повреэедения и компенсации исследуемого органа и организма в целом.

Исследованиями ряда авторов (М.М.Рахимов с соавт., 1977; К. Т. Алматов с соавт., 1977; К. Т. Алматов, 1978; Х. Агзамов, 1982 и др.) показано, что применение биохимических методов (в частности, исследование стабильности полиферментных систем митохондрий к различным повреждающим воздействиям) позволяет установить не только явные, но и так называемые скрытые повреждения мембран митохондрий. Это было показано на примере аллоксанового диабета, гепатита, язвенного колита, а также таких стрессовых воздействиях, как голодание, перегревание и пр. Представлялось важным изучение ста~ бильности полиферментных систем митохондрий к деградирующему влиянию повышенной температуры при различном течении кровопотери и шока, а также зависимости от степени декомпенсации функций организма.

Установленное некоторыми авторами, в том числе и нами (Г.С. Левин с соавт., 1972;1982; Г. Я. Тремасова, 1979; Л. В. Слепнева, 1981;

A.E.Baue с соавт., 1974; L. Mella, 1973), замедление потребления кислорода дыхательной цепью митохондрий печени при крово-потере и шоке также требовало объяснения. Выяснение причин и механизмов этого явления необходимо в связи с возможностью воздействия на функции дыхательной цепи препаратами, способными модифицировать ее. Представлялось существенным изучение синтетических производных 1,4-нафтохинона в качестве модификаторов дыхательной цепи митохондрий в опытах in vitro и in vivo. Результаты таких исследований могли бы послужить основой для рекомендаций об использовании модификаторов дыхательной цепи в комплексном лечении геморрагического шока.

В настоящей работе проводилось исследование состояния мито-ховдриального окисления и активности основных полиферментных систем митохондрий печени кроликов при кровопотере и «необратимом» геморрагическом шоке. Кроме того, изучены электроноакцепторные свойства 9 соединений 1,4-нафтохинона в опытах с ингибированием переноса электронов по дыхательной цепи. Сделана попытка применить один из наиболее активных препаратов при отравлении животных цианидом и при экспериментальном геморрагическом шоке.

Работа выполнена в рамках Государственных программ С. 03. «Научные и организационные основы трансфузиологии» и С. 06. «Скорая помощь и реанимация при неотложных состояниях». Работа также включена в программу «Механизмы различной резистентности организма к экстремальным факторам среды и пути ее целенаправленного изменения», головным учреждением которой является Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось установление основных механизмов, приводящих к нарушению митохондриального окисления в клетках печени животных при кровопоте-ре и геморрагическом шоке, а также изыскание путей нормализации нарушенных функций.

В работе были поставлены следующие задачи:

— исследовать состояние дыхания, окислительного фосфорили-рования, а также активности и термостабильности полиферментных систем митохондрий печени кроликов при кровопотере и геморрагическом шоке;

— установить зависимость степени изменений нарушенных функций митохондрий от характера течения процесса;

— исследовать в опытах in vitro и in vivo электроноакцеп-торные свойства ряда синтетических производных 1,4-нафтохинона (ингибиторный анализ);

— определить влияние одного из препаратов 1,4-нафтохинона на функциональное состояние митохондрий печени в «необратимой» фазе геморрагического шока у кроликов.

Научная новизна. — Впервые дана комплексная оценка состояния митохондриального окисления и выявлены особенности функционирования митохондрий печени при кровопотере и «необратимой» стадии геморрагического шока.

— Выявлено, что нарушения электронотранспортной функции митохондрий печени четко коррелируют со степенью гипоксии и метаболического ацдцоза. У животных с неблагоприятным течением процесса уже на стадии кровопотери имеются выраженные нарушения ми-тохондриальных функций.

— Получены данные о преимущественном нарушении транспорта электронов в дистальном участке дыхательной цепи митохондрий печени при тяжелом геморрагическом шоке.

— Исследованы 9 соединений 1,4-нафтохинона в качестве средств, способных модифицировать дыхательную цепь митохондрий печени. Установлено, что некоторые производные 1,4-нафтохинона в зависимости от строения боковой цепи способны шунтировать отдельные звенья или всю дыхательную цепь митохондрий печени.

— Установлено, что препараты 1,4-нафтохинона, шунтирующие участок цитохромоксидазы, продлевают жизнь животных, отравленных смертельной дозой циандда.

— Показано, что само по себе восполнение дефицита объема крови (реополиглюкином) не оказывает влияния на функцию митохондрий печени при «необратимом» геморрагическом шоке. Добавление соединений 1,4-нафтохинона к реополиглюкину способствует восстановлению транспорта электронов, что сопровождается повышением процента выживаемости и увеличением продолжительности жизни животных, находившихся в «необратимой» стадии геморрагического шока.

Практические рекомендации. — Подтверждена гипотеза о роли нарушения транспорта электронов в дыхательной цепи митохондрий в патогенезе необратимости шока, позволившая рекомендовать новый принцип выведения организма из этого состояния. Он заключается в применении искусственных акцепторов электронов, шунтирующих заблокированные участки дыхательной цепи, в комплексе с восстановлением дефицита объема крови.

— Показана целесообразность контроля за степенью метаболического ацидоза в качестве показателя глубины нарушения мито’хоцд-риальных функций печени при геморрагическом шоке.

— Разработаны критерии наступления «необратимой» фазы геморрагического шока у экспериментальных животных.

— Разработано и применено оригинальное устройство для измель" чения биологических тканей, позволившее увеличить выход функционально полноценных митохондрий для исследований.

ВЫВОДЫ.

1. Острая массивная кровопотеря характеризуется нарушением электрон отранспортной и энергопреобразующей функций митохондрий печени. Изменения митохондриальных функций четко коррелируют с выраженностью гипоксии и степенью метаболического ацвдоза. При неблагоприятном течении кровопотери митохондрии печени переходят в низкоэнергетическое состояние, сопровождающееся увеличением доли нефосфорилирушцего окисления.

2. После кровопотери отмечено снижение активности и термостабильности полиферментных систем митохондрий, а также способности экзогенного цитохрома С активировать процесс переноса электронов по дыхательной цепи. Избыток соответствующих субстратов окисления не способствует восстановлению нарушенной активности оксидазных систем.

3. В «необратимой» фазе геморрагического шока происходит дальнейшее нарушение дыхательной и фосфорилирупцей функций митохондрий печени. Степень нарушений находится в соответствии с глубиной декомпенсации гемодинамических и метаболических процесс сов. При неблагоприятном течении шока наблюдается не только снижение активности дыхательной цепи, но и угнетение скорости свободного окисления.

4. В терминальной фазе шока, особенно при неблагоприятном течении его, снижается активность и стабильность всех полиферментных систем митохондрий печени. Установлено, что снижение активности цитохромоксвдазы является лимитирующим фактором в процессе переноса электронов по дыхательной цепи.

5. При кровопотере окисление НАД. Н в СМЧ печени происходит преимущественно через ротеноннечувствительную НАД’Н-оксадазу, хотя активность этого пути снижена по сравнению с контролем. В «необратимой» фазе геморрагического шока снижается доля участия этого пути переноса электронов.

6. Из соединений, относящихся к классу 1,4-нафтохинона, выявлены препараты, увеличивающие скорость свободного окисления субстратов и обладающие способностью шунтировать заблокированную в различных звеньях дыхательную цепь. Препараты, шунтирующие редокс-цепь митохондрий печени при блокировании ее ротеноном, антимицином, А и цианидом (АК-122 и АК-135), увеличивают продолжительность жизни и выживаемость крыс, отравленных смертельной дозой цианида, а также кроликов с «необратимым» геморрагическим шоком.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Известно, что одним из свойств, присущих живой ткани, является способность к поддержанию стационарных состояний. Эта способность, по-видимому, тесно связана с энергетическим обменом, в котором у теплокровных животных и человека основная роль принадлежит митохондриям.

За последние годы отмечается значительный рост числа работ, посвященных изучению роли митохондриального окисления в изменениях физиологического состояния организма под влиянием внешних факторов. Исследование функциональных и структурных изменений митохондрий значительно способствовало прогрессу в изучении сущности и механизмов развития многих патологических процессов, в том числе при таких экстремальных условиях, какие создаются при кровопо-тере и шоке.

Особую важность для практики имеют работы, направленные на изучение патогенеза терминальной или т.н. необратимой стадии шока, когда имеющимися средствами не удается сохранить больному или раненному жизнь. В последние годы все большее распространение приобретает гипотеза о главенствующей роли дефицита энергии в возникновении необратимых изменений при кровопотере и шоке. Между тем имеющиеся в литературе сведения об энергетическом обмене при этих процессах малочисленны, фрагментарны, нередко противоречивы и, как правило, не предусматривают принципиально новых подходов к проблеме нормализации функций митохондрий при кровопотере и особенно «необратимой» фазе шока.

В связи с этим в настоящей работе поставлены задачи (см.

Введение

), при успешном решении которых могли бы возникнуть перепективы в изучений механизмов необратимости и изыскании эффективных средств лечения кровопотери и шока.

Для решения поставленных задач проведены 13 серий опытов, в которых использованы 190 кроликов и 238 крыс. Эксперименты показали, что характерной реакцией организма на кровопотерю со стороны митохондрий печени является снижение скорости переноса электронов по дыхательной цепи и скорости образования АТФ. Так, при окислений митохондриями сукцината у животных с кровопотерей скорости дыхания были достоверно снижены: в состоянии 3 — на 32,6%, в состоянии 4 — на 30,7%, после добавления 2,4-ДНФ — на 40,5%. Время фосфорилирования было увеличено на 39%. При окислении глу-тамата снижение названных показателей составляло 36%, 47% и 43% соответственно.

Анализ каждого эксперимента в отдельности позволил установить, что выявленные нарушения электронотранспортной и энергопре-образупцей функций митохондрий четко коррелируют со степенью выраженности гипоксии и метаболического ацидоза. В то же время степень изменения гемодинамических показателей не играла существенной роли для формирования нарушений функций митохондрий печени.

В соответствии с этими данными все животные были условно разделены на две группы. У кроликов с т.н. благоприятным течением процесса (группа I) рН артериальной крови снижался не более, чем на 0,1, а температура тела — на 1,1 * 0,12°С. При этом объем кровопотери составлял 2,41 * 0,08% к массе тела, а время, необходимое для достижения установленного уровня АД (40 мм рт.ст.) было равно 80,8 * 7,19 мин. При неблагоприятном течении процесса (группа П) при примерно одинаковых с группой I показателях объема кровопотери (2,43 * 0,12%) и времени кровопускания (62,5 *.

5,34 мин) снижение рН артериальной крови и температуры тела было более выраженным — рН снижался на 0,29 1 0,034, а температура тела на 2 °C и ниже.

При типичном течении кровопотери (группа I) скорость окисления сукцината снижалась незначительно по сравнению с нормой. Так, показатели У2, Уд, У^, были равны соответственно.

9,4? 0,48, 24,3? 0,09, 8,7 ± 0,5, 24,5? 0,1 яА02/мия-мг белка. У интактных животных эти же показатели имели следующие значения: 10,1? 0,49, 31,3? 1,33, 11,1? 0,59, 36,3? 2,2 нА02/мин*:мг белка. Время фосфорилирования, а также показатели АДФ/О, ДК^ практически не отличались от данных, полученных на контрольных животных. При окислении глутамата наблкдалась аналогичная картина состояния электронотранспортной функции митохондрий.

У животных группы П при окислении сукцината митохондриями показатели V 2, «Уд, V V были достоверно снижены не только по сравнению с нормой (на 24%, 66 $, 48% и 57,5% соответственно), но и по отношению к группе I (на 20%, 45%, 34% и 38%). Время фосфорилирования было увеличено на 91% против нормы и на 77,7% по сравнению с группой I. При окислении глутамата наблюдалась аналогичная картина нарушений электронотранспортной функции митохондрий.

В литературе имеются указания (М.Н.Кондрашова, 1979) на то, что при глубоких стадиях гипоксических состояний, вызванных патологическими процессами, в том числе различными видами шока, в тканях наблкдаетея ацидоз, торможение дыхательной цепи митохондрий протонами и АДФ, а также индуцируемое лактатом набухание этих ор-ганелл. (.Маркарян (1971) считает, что пусковой причиной закисле-ния ткани и крови является не нарушение бикарбонатной буферной системы, а избыточная генерация протонов дыхательной цепью митохондрий.

С целью исключения избыточного сопрягающего действия ЭДТА яа митохондрии печени были проведены опыты, в которых в среде измерения этот комплексон отсутствовал. Имеются данные (В.П.Скулачев, 1969, Г. 11.Гулддова, 1979 и др.), свидетельствующие о том, что ЭДТА в повышенных концентрациях (до I ммоль) может нормализовать энергетический обмен в связи с его ингибирующим действием на АТФ-азную активность и подавлением свободнорадикальных реакций. Эксперименты показали, что при кровопотере, сопрововдающейся резко выраженным метаболическим ацидозом, митохондрии печени переходят в нйзко-энергетическое состояние с увеличением доли свободного окисления, на что указывает резкое повышение скорости окисления экзогенного сукцината без стимуляции дыхания добавленным АДФ. Однако этот процесс является обратимым, так как с помощью ЭДТА удается восстановить энергетический обмен в митохондриях, хотя восстановление происходит в ущерб переносу электронов.

Для выяснения возможной причины и места торможения функции дыхательной цепи митохондрий печени животных при кровопотере исследовали активность и термостабильность оксидазных систем СМЧ печени, непосредственно участвующих в транспорте электронов.

Проведенные исследования показали, что при кровопотере нарушение переноса электронов по редокс-цепи сопровождается снижением активности полиферментных систем СМЧ печени, степень которого четко коррелирует с характером течения процесса, при благоприятном течении кровопотери активность ПС СМЧ печени была достоверно снижена по сравнению с нормой: НАД*Н-оксддазы — на 43 $, сукцинат-оксидазы — на 36 $, цитохром С-оксидазы — на 31,4 $. У животных с выраженной гипоксией и ацидозом снижение активности соответствующих оксидазных систем оыло более выраженным и составляло 46%, 54% и 55% по сравнению с нормой. Подавление активности сукцинат-оксидазы и цитохром С-оксидазы было статистически достоверно большим, чем в первой группе.

Добавление экзогенного цитохрома С к СМЧ выявило неодинаковое отношение к нему оксидазных систем: прирост активности НАД*Н-оксидазы в этих условиях был значительно выше, чем в случае сук-цинатоксидазы. Вместе с тем этот компонент дыхательной цепи не способен был восстановить нарушенную при кровопотере активность иС до нормального уровня.

Исследование термостабильности оксидазных систем СМЧ печени показало, что при кровопотере экзогенный цитохром С не предохранял НАД*Н-02 и сукцинат-02 от деградирующего действия повышенной температуры. Так, в одинаковых условиях термостатирования время 50-процентного ингибирования (* 5^) активности НАД*Н-оксвдазы СМЧ печени контрольных животных составляло 190 мин, а при кровопотере — 130 мин, причем степень ингибирования ее была выше у кроликов с тяжелым течением процесса. Для сукцинатоксидазы 1- ?^ составляло: в норме — 200 мин, при кровопотере — 150 мин (I группа) и 90 мин (П группа).

Исследование защитного эффекта субстратов окисления на термостабильность ПС показало, что из всех субстратов только НАД’Н^ предохранял процесс активации цитохромом С НАД*Н~оксидазы от повреждающего действия температуры. Однако степень активации им данной ПС оставалась сниженной по сравнению с нормой, особенно в группе животных с выраженной гипоксией.

При исследовании активности цитохром С-оксидазы в этих же условиях было выявлено, что у интактных животных избыток цитохро-ма С способствует стабилизации их мембран, в то время как при кровопотере этот компонент дыхательной цепи не только не предохраняет цитохром С-оксддазу от деградирующего действия температуры, но даже несколько угнетает ее активность.

Высокая стабильность активированной цитохромом С НАД"Н-окси-дазы при избытке экзогенного НАД-Е^ указывает на активацию им внешнего пути, поскольку известно (В.П.Скулачев, 1969 и др.). что НАД. Н служит наилучшим субстратом для внешнего пути и наиболее активным восстановителем для цитохрома в^.

Одной из причин торможения цепи переноса электронов может быть также накопление в печени различных токсических соединений, тормозящих редокс-цепь в различных ее звеньях и ставящих тем самым под угрозу всю систему энергообеспечения печеночной клетки. В этих условиях включение шунта свободного окисления должно реактивировать дыхание.

На наш взгляд, такие условия могут возникнуть при кровопотере, прежде всего в связи с тем, что при этом процессе закономерно возникает ацидоз в крови и тканях. Факт же стимуляции внешнего пути окисления НАД. Н митохондриями печени при закислении среды можно считать доказанным (А.П.Агуреев с соавт., 1981 и др.). В связи с этим представлялось важным установление роли внешнего пути в поддержании энергетического гомеостаза при кровопотере.

Данные ингибиторного анализа, проведенного на СМЧ печени здоровых и опытных животных, показали, что при кровопотере окисление НАД*Н происходит преимущественно по ротеноннечувствительно-му пути. Вместе с тем его активность составляла 73% уровня нормы. Эти данные согласуются с мнением М. Н. Кондратовой с соавт.(1977) о том, что при переходе от нормы к патологии или от высокоэнергетических состояний к низкоэнергетическим происходит не просто ослабление одних и усиление других биохимических превращений, а альтернативное переключение путей метаболизма.

С этих позиций представляется возможным объяснить наблюдавшийся некоторыми авторами (Л.Г.Богомолова с соавт., 1965; л.В. Слепнева с соавт., 1981 и др.) эффект от применения цитохрома С при лечении кровопотери. Надо полагать, что наиболее вероятным механизмом действия цитохрома С в этих условиях является активация им внешнего пути окисления НАД"Н.

Наблюдаемая на СМЧ высокая активация цитохромом С окисления НАД"Н (но не сукцината) и сохранение высокой термостабильности НАД. Н-О2 в его присутствии, а также преимущественное окисление НАД. Н по ротеноннечувствительному пути дают возможность предположить, что при кровопотере снижение электронотранспортной функции митохондрий печени связано с нарушением окислительно-восстановительной функции эндогенного цитохрома С, а не с функцией ци-тохромоксидазы. По-видимому, снижение активности цитохром С-ок-садазы, полученное на СМЧ, не является лимитирующим фактором в переносе электронов по главной цепи. Доказательством этому служат данные специально проведенных экспериментов с использованием в качестве доноров электронов системы аскорбат + ТМФД. полученные результаты указывают на то, что активность терминального звена дыхательной цепи митохондрий печени опытных кроликов не является лимитирующим фактором для переноса электронов.

В «необратимой» фазе шока у всех животных наблюдалось достоверное снижение рН артериальной крови (6,99 * 0,03), что свидетельствовало о резко выраженной гипоксии. Такому состоянию животных соответствовало более выраженное, чем при кровопотере, снижение скорости дыхания митохондрий печени. Однако степень нарушения процесса переноса электронов была неодинаковой у разных животных. В связи с этим кролики были разделены на 2 группы: с относительно благоприятным (группа I) и относительно неблагоприятным группа 11) течением процесса. Основными критериями при этом служили выраженность метаболического ацидоза и гипотермии, а также степень декомпенсации гемодинамики.

При исследовании функционального состояния митохондрий печени кроликов в «необратимой» фазе шока, как и при кровопотере, была установлена четкая корреляция между степенью нарушения окислительных процессов и характером течения шока. Так, митохондрии печени животных группы П обладали значительно более низкими скоростями дыхания, чем животные группы I, причем только 53,8% препаратов митохондрий обладали фосфорилирувдей способностью, хотя в среде измерения присутствовал ЭДТА. При отсутствии в среде измерения комплексона только 37% препаратов митохондрий оказались способными к фосфорилированию, причем все они принадлежали животным группы I. Эти данные свидетельствуют о более глубоких нарушениях ми-тохонцриального аппарата печени при шоке по сравнению с фазой кровопотери. параллельное исследование состояния полиферментных систем СМЧ печени кроликов с шоком также выявило нарушение их активности и термостабильности, особенно сукцинатоксидазы. Так, у животных группы П ее активность была достоверно снижена на 50% по сравнению с нормой и на 32% относительно группы 1. Добавление цитохро-ма С к СМЧ при измерении НАД*Н-оксидазной и сукцинатоксидазной активностей показало, что способность его активировать данные ПС митохондрий печени животных группы II ниже, чем в контроле и у кроликов с относительно благоприятным течением шока.

Сравнение этих результатов с данными, полученными у кроликов с кровопотерей не выявило принципиальной разницы в уровнях активностей ПС, а также в стабильности их к действию повышенной температуры. Это, по-видимому, может указывать на довольно раннее поражение дыхательной цепи у части животных при кровопотере. Здесь следует указать, что печень при кровопотере и шоке выполняет функцию, во многом определяющую столь раннее нарушение метаболических процессов в ней. Являясь основным поставщиком энергии в экстремальных условиях, она уже вскоре после кровопотери теряет основную часть своего гликогена, причем эта функция необходима для выживания организма (Г.С.Левин с соавт., 1978, 1982).

При исследований термостабильности оксидазных систем СМЧ в присутствии избытка соответствующих субстратов оказалось, что у животных с неблагоприятным течением шока степень дестабилизации цитохром С-оксидазы, наиболее стойкой из всех систем к повреждающему действию температуры, была выше, чем у кроликов на фазе кровопотери. Эти данные свидетельствуют о том, что экзогенный цитохром С. не участвует в повышении активности и сохранении стабильности цитохром С-оксидазы СМЧ печени при тяжелом течении геморрагического шока.

На более выраженные изменения митохондрий печени при шоке по сравнению с кровопотерей указывают данные, полученные при изучении доли внешнего пути окисления НАД"Н на этой стадии процесса. Выключение основной цепи ротеноном и последующее добавление цито-хрома С приводило к увеличению окисления НАД. Н, но оно было на 44% ниже, чем в норме, и на 24% по сравнению с исходной активностью. Очевидно, внешний путь в митохондриях печени при шоке / уже не в состоянии компенсировать дефицит окисления НАД"Н в основной цепи, подобно тому как это имело место при кровопотере.

Вероятной причиной снижения активности всех ПС дыхательной цепи митохондрий печени и ротеноннечувствительной НАД"Н-оксида-зы при шоке может быть нарушение функции цитохромоксидазы, являющейся общим звеном редокс-цепи и внешнего пути переноса электронов. Подтверждением этому служили результаты опытов, проведенных на нативных митохондриях печени кроликов, с использованием системы аскорбат + ТМфД. Полученные данные свидетельствуют о том, что при тяжелом течении шока активность цитохромоксидазы снижена на 40% по сравнению с нормой.

Известно (Д.Грин с соавт., 1968), что цитохром С может связываться с фосфолипадами, образуя связи электростатического характера. Образование комплексов с цитохромом С характерно и для фосфолипадов митохондрий. При удалении фосфолипида из дыхательной цепи ее способность к переносу электронов нарушается вследствие агрегации мембранных белков. При кровопотере и шоке в мембранах митохондрий печени возникают нарушения, которые выявляются при термоинактивации митохондрий. Эти повреждения не удается устранить с помощью субстратов, добавляемых в избытке в среду инкубации (феномен «защиты функционированием» отсутствовал). Такие повреждения могут быть связаны с разрушением комплексов «цитохром С-фосфолипиды» фосфолипазами, активность которых возрастает при нарушении целостности мембран (А.п.Агуреев, Е. Н. Мохова, 1979), что, по-видимому, свойственно кровопотере. Это предположение подтверждается данными Ц. Л. Каменецкой (1982), показавшей, что при кровопотере и шоке в печени происходит снижение содержания фосфолипидов.

Известно (В.Н.Лузиков, 1973), что активация фосфолипазы в первую очередь сказывается на участке дыхательной цепи в области цитохрома С. Кроме того, Рахимовым с соавт. (1978) получены данные в пользу предположения о модификации фосфолипазой Д площадки посадки цитохрома С на мембране митохондрий.

При разрушении комплексов «цитохром С-фосфолипдды» может на-блвдаться нарушение «челночной» функции цитохрома С, а также частичная солюбилизация его из внутренней митохондриальной мембраны в межмембранное пространство. В результате этого в редокс-цепи снижается транспорт электронов. Цитохром С, попадая в межмембранное пространство, может служить компонентом внешнего пути окисления НАД. Н, что согласуется с данными В. П. Скулачева (1969), указывающими на включение внешнего пути при десорбции некоторого количества цитохрома С из внутренней мембраны в межмембранное проста ранство.

При кровопотере этот путь переноса электронов становится жизненно важным и может оказаться преимущественным, что и удалось показать с помощью ингибиторного анализа. Добавленный цитохром С, по-видимому, не участвует в переносе электронов по главной цепи из-за уменьшения количества фосфолипддов и нарушений фосфолипдц-белковых взаимодействий. Оставаясь в межмембранном пространстве, он активирует внешний путь окисления НАД*Н. Учитывая тот факт, что в состав этого пути входит цитохромоксадаза внутренней мембраны, становится объяснимой наблюдаемая при кровопотере относительно высокая стабильность этой ПС.

С этих позиций находит объяснение резкое снижение активности сукцинатоксддазы и цитохром С-оксидазы, поскольку окисление сукцината и цитохрома С осуществляется через дыхательную цепь, а в условиях кровопотери функционирование этях ПС нарушено из-за недостаточности окислительно-восстановительной функции эндогенного цитохрома С.

По мере развития «необратимой» стадии шока в результате сниженной перфузии жизненно важных органов, в частности печени, происходит декомпенсация гемодинамических и метаболических процессов. При этом в митохондриях печени возникают не только нарушения процессов переноса электронов и образования энергии, но и уменьшение степени включения внешнего пути, вызванное, по-видимому, торможением функции цитохромоксидазы.

Механизм выявленных нарушений функционального состояния митохондрий сложен. Можно полагать, что при геморрагическом шоке определенная роль принадлежит активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биомембранах. К настоящему времени мо-. жет считаться установленным факт влияния продуктов ПОЛ на структуру и функцию биологических мембран, в том числе митоховдриаль-ных (Ю.А.Владимиров, А. И. Арчаков, 1972). Имеется даже мнение, что в клетке главным местом образования свободных радикалов являются митохондрии (¿-'.ШавЬЪигп, ?г.Ни11еу, 1973), причем свободные радикалы, взаимодействуя с ненасыщенными жирными кислотами клеточных и субклеточных мембран, ведут к образованию липидных перекисей, повреждающих сами мембраны. Показано, что при разных функциональных состояниях митохондрий способность митохондриальных липидов подвергаться действию молекул кислорода различно, что связывается с изменениями в конформации фосфолипид-белковых комплексов мембран (М.В.Ситковский с соавт., 1973).

Наиболее изученными являются процессы пере окисления липидов митохондрий сердца, особенно в условиях стресса и ишемии миокарда (Ф.З.Меерсон с соавт., 1979,1982; E.M.steen с соавт., 1982 и др.). Показано, что важным звеном патогенеза ишемического повреждения сердца при инфаркте является т.н. липидная триада, реализующаяся в липидном бислое мембран кардиомиоцитов. Эта триада слагается из активации ПОЛ, активации фосфолипаз и детергентного действия высоких концентраций жирных кислот. Такое сочетание приводит к увеличению проницаемости мембран для кальция и играет важную роль в переходе обратимых ишемических повреждений в необратимые. Активация ПОЛ при инфаркте миокарда в ишемизированной и неишемизированной зонах, по-видимому, является звеном, запускающим «липаднукг триаду» .

Продукты ПОЛ при окислении сукцината могут действовать как разобщители дыхания, тогда как при окислении глутамата + малата ОНИ ингибируют перенос электронов (T.Imagawa, T. Nakamura, I98I). Дыхательной цепи принадлежит важная роль в одновалентном переносе электронов к молекулярному О2, образовании Н2О2 и, в последующем, появлению свободных радикалов (H.Nohl, 1981). G. Loschen, A. Azzi (1976) считают, что компоненты дыхательной цепи, локализованные между участками, чувствительными к ротенону и антимицину А, прямо реагируют с молекулярным кислородом с образованием Интересны результаты, полученные А. А. Кондрашиным, Т. Т. Березовым (1980), показавшими, что липиды митоходдрий гепатомы могут быть ответственными за изменения функции цитохромокеидазы и нарушения сопряжения в цитохромоксадазном звене дыхательной цепи.

Приведенные данные могут оказаться полезными при объяснении механизма нарушения биологического окисления в митохондриях печени при кровопотере и шоке. Исследования, посвященные изучению ПОЛ при этих процессах, представлены лишь в работе Г. С. Левина, Ц. Л. Каменецкой (1982), показавших, что при геморрагическом шоке, наряду со снижением уровня фосфолипидов, нарастает концентрация в крови и митохондриальном супернатанте конечного продукта ПОЛмалонового диальдегида. Авторы придают этому факту патогенетическую роль, поскольку активация ПОЛ была выше у погибших животных.

На основании полученных результатов можно заключить, что печень, являясь органом, чья функция находится в наибольшей зависимости от условий кровоснабжения, очень рано реагирует изменениями энергетического обмена в митохондриях в ответ на кровопотерю и последующую гипотензию. Эти нарушения четко коррелируют со степенью выраженности гипоксии и метаболического ацидоза. Угнетение внешнего пути окисления НАД"Н лимитирует возможности клетки при шоке «задействовать» цепь переноса электронов путем «сброса» избытка протонов через один из альтернативных путей, в связи с чем требуются принципиально новые подходы для восстановления функции дыхания клеток.

В нашей лаборатории в течение ряда лет ведутся исследования по экспериментальной терапии терминальной стадии геморрагического шока препаратами, которые могут служить искусственными акцепторами электронов (ИАЭ). Нами были проведены исследования 9 препаратов из группы 1,4-нафтохинонов, условно названных АК-44, АК-45, АК-90, АК-100, AK-IG4, AK-I05, AK-I08, AK-I22, АК-135 и отличающихся между собой строением радикалов в положениях 2 и 3, а также величиной окислительно-восстановительного потенциала (0B1I). Изучали влияние названных препаратов на процесс переноса электронов в нативных митохондриях и активность полиферментных систем СМЧ печени (акцепторные свойства препаратов). Параллельно устанавливались место включения этих веществ в цепь переноса электронов и их способность шунтировать различные звенья дыхательной цепи подле блокирования соответствующими ингибиторами.

Исследования, выполненные на митохондриях печени интактных крыс, показали, что некоторые соединения класса 1,4-нафтохинона проявляли выраженные акцепторные свойства, приводя к ускорению транспорта электронов по дыхательной цепи и увеличению доли не-фосфорилируюцего окисления. По степени ускорения свободного окисления было установлено, что наиболее активными из действующих акцепторов являются AK-I22 и АК-135.

Проведенный ингибиторный анализ показал неодинаковую способность различных АК к шунтированию дыхательной цепи, заблокированной ротеноном, антимицином, А и цианидом. Из всех соединений этого класса наибольший интерес для патогенетической терапии «необратимой» фазы шока представляли вещества, способные шунтировать терминальный участок редокс-цепи. Они (АК-44, AK-I22 и АК-135) транспортировали электроны с глутамата (на нативных митохондриях) и с НАД’Н (на СМЧ) прямо на кислород, минуя все заблокированные участки дыхательной цепи, причем со скоростью, в несколько раз превышающей скорость окисления субстратов.

Свойство указанных АК шунтировать заблокированную дыхательную цепь было использовано в опытах in vivo при исследований продолжительности жизни крыс, отравленных смертельной дозой цианида. Как показали исследования, два препарата (AK-I22 и АК-135)в различных дозах оказали профилактическое влияние, значительно увеличив продолжительность жизни и выживаемость животных. При высокой достоверности разницы в продолжительности жизни 6 из 29 крыс (при введении АК-135)и 6 крыс из 26 (при введении AK-I22) прожили более 24 часов (срок наблкдения), в то время как контрольные крысы не прожили более 10 мин. Характерно то, что ни цитохром С, ни препарат АК-45, шунтирущий по нашим данным лишь первый пункт сопряжения, не оказали эффекта в аналогичных опытах с отравлением крыс цианадом.

Способность препаратов 1,4-нафтохинона шунтировать терминальный отрезок дыхательной цепи была также использована для регуляции транспорта электронов в «необратимой» стадии геморрагического шока. Принимая во внимание значительные нарушения системной гемодинамики, микроциркуляции и реологических свойств крови при шоке, кроликам опытной группы вводили кровезаменитель реопо-лиглюкин (РПГ) в объеме, равном величине кровопотери, в сочетании с AK-I35 (1,2 мг/кг массы тела), контрольной — лишь РПГ в том же объеме.

Введение

препаратов осуществляли при достижении практически одинаковых проявлений шока.

Определение показателей дыхательной и фосфорилируицей функций митохондрий печени через I час после вливания РПГ в смеси с AK-I35 показало, что препарат AK-I35 приводил к повышению скорости окисления сукцината, чего не наблюдалось только при восполнении объема кровопотери с помощью РПГ. Так, при введении смеси РПГ + AK-I35 животным с неблагоприятным течением шока скорость дыхания митохондрий печени на сукцинате увеличивалась: в состоянии 3 на 57,3% (р-с. 0,01), в состоянии 4 — на 49% (р-с 0,01), а после добавления 2,4-ДНФ — на 50% по сравнению с показателями у аналогичной группы животных до введения препаратов. При окислении глутамата митохондриями печени кроликов этой же группы практически все препараты митохондрий обладали фосфорилируицей способностью, хотя скорость дыхания оставалась сниженной. Кроме того, он способствует улучшению утилизации энергии тканями даже при неблагоприятном течении шока, чего не удается достичь лишь при восполнении объема потерянной крови.

Исследования состояния ПС СМЧ печени животных через I час после введения РПГ и его смеси с АК-135 показали, что и в контроле, и в опыте активность и термостабильность НАД*Н-оксидазной и сукцинатоксидазной систем были примерно одинаковыми и мало отличались от данных, зарегистрированных до введения препаратов. Вместе с тем при исследовании цитохром С-оксидазы СМЧ печени животных с тяжелым течением шока было установлено, что, хотя ее активность и термостабильность оставались сниженными, но были выше, чем у животных, которым вводился только РПГ. Так, после введения кроликам группы П только РПГ активность цитохром С-0£ в начальный период инкубации составляла 14,5? 2,7 нАС^/мин/мг белка, а к концу тер-мостатирования — 11,6? 1,33. В эти же промежутки времени у животных при шоке той же тяжести, но после вливания смеси РПГ + АК-135, активность этой ПС была равна соответственно 23,5? 7,8 и 21? 4,6 нА02/мин/мг белка.

В опытах по модификации дыхательной цепи митохондрий печени препаратами 1,4-нафтохинона было показано, что процесс активации окисления сукцината АК-135 и подобными ему соединениями является энергозависимым, так как протекает лишь в нативных митохондриях в отсутствии каких-либо ингибиторов переноса электронов. Были проведены специальные опыты с ингибированием окисления сукцината роте-ноном. Последний предотвращал стимуляцию дыхания АК-135, хотя на окисление самого сукцината не влиял. Если же ротенон добавлялся после АК-135, то скорость дыхания снижалась до первоначального уровня. Предполагается, что АК-135 акцептирует электроны с НАД’Ндегидрогеназы, куда они поступают от сукцината за счет обратного переноса.

Учитывая тот факт, что при геморрагическом шоке, сопровождающемся выраженным метаболическим ацидозом, степень восстанов-ленности эндогенных пиридиннуклеотидов может возрастать, становится объяснимым положительный эффект АК-135 на функцию окисления сукцината митохондриями печени кроликов с тяжелым течением процесса. По-видимому, за счет обратного переноса электронов от сукцината АК-135 способствует окислению восстановленных пиридиннуклеотидов через цианиднечувствительный альтернативный путь.

Положительный эффект АК-135 в отношении повышения электро-нотранспортной функции митохондрий печени, а также цитохром С-оксидазы, выявленный именно в группе с ярко выраженной декомпенсацией гемодинамики и метаболизма, подтверждают мнение о том, что наиболее рациональным способом восстановления функции митохондрий является модификация дыхательной цепи с целью «сброса» восстановленных эквивалентов на кислород, минуя цитохромоксида-зу. Об этом же свидетельствуют данные выживаемости кроликов, которым при достижении «необратимой» фазы шока вводили смесь РПГ и АК-135 (в контроле — РПГ). Добавление к РПГ препарата АК-135 в дозе 1,2 мг/кг массы тела привело к увеличению продолжительности жизни подопытных животных почти вдвое по сравнению с введением только РПГ. Кроме того, из 15 кроликов, которым был введен РПГ не прожил более 24 часов ни один, в то время как после введения РПГ + АК-135 выжило 4 из 19 животных (21%, р⁰, 05).

Уместно отметить, что исследованные соединения 1,4-нафтохи-нона в опытах in vitro существенно снижали уровень конечного продукта ПОЛ, проявляя свойства антиоксидантов (Г.С.Левин, Ц, Л.

Каменецкая, 1982). Установленное нами ускорение переноса электронов по редокс-цепи и ингибирование ИОЛ под влиянием препаратов 1,4-нафтохинона находятся в соответствии с данными R. Takayanagi с соавт. 1980) о том, что накопление малонового диальдегида в суб-митоховдриальных частицах сердца быка достигало максимального значения при низкой скорости переноса электронов от НАД. Н по дыхательной цепи и уменьшалось при повышении этой скорости. Важно, что ПОЛ в этих опытах индуцировалось НАД-Н, а по нашему мнению, эффективность ИАЭ обусловлена отчасти снижением концентрации НАД. Н в результате окисления его по альтернативному пути.

Таким образом, данные, полученные при использовании ИАЭ в опытах in vivo на модели «необратимого» геморрагического шока подтвердили правильность предположения о’ведущей роли в патогенезе необратимости шока нарушения транспорта электронов в дыхательной цепи, особенно в ее терминальном звене. Одновременно была показана принципиальная возможность выведения организма из т.н. необратимой фазы шока с помощью химических соединений, модифицирующих дыхательную цепь митохондрий и позволяющих осуществить транспорт электронов с восстановленных переносчиков на кислород, минуя цитохромоксидазу.