Материал и методика

Для проведения исследования были взяты личинки 1-IV возрастов, белые куколки и имаго земляного шмеля. Гемолимфу личинок получали путем укола иглой в ложноножку, у куколок и имаго — путем прокалывания спинного кровеносного сосуда в области брюшка. У личинок срезали кутикулу на спинной стороне тела, в области перикардия и прижимали поверхность предметного стекла к срезу, в результате этого на мазок попадали клетки, находящиеся в прикрепленном виде. Полученные мазки гемолимфы и мазки-отпечатки фиксировали смесью Карнуа, метиловым спиртом и нейтральным формалином, затем окрашивали по Романовскому-Гимза и кислым гемалауном по Майеру. Для выявления ДНК использовали реакцию Фельгена, а также метиловый зеленый-пиронин для выявления ДНК и РНК. Белки окрашивали бромфеноловым синим, полисахариды определяли с помощью реакции ШИК, для выявления гликогена использовали раствор Люголя. Для выявления липидов и нейтральных жиров использовали судан черный В и судан красный III. Цитохимический анализ проводили с ферментативным контролем.

Результаты и обсуждение

В гемолимфе земляного шмеля B. terrestris в соответствии с классификацией Сиротиной М. И. и Черной Г. С. (1965) нами были выделены следующие типы гемоцитов: прогемоциты, макронуклеоциты, фагоциты, сферулоциты и эноцитоиды. Исследования показали, что в ходе онтогенеза количественное соотношение данных типов гемоцитов изменяется в зависимости от стадии развития насекомого и определяется процессами гемоцитопоэза. Полученные нами мазки — отпечатки перикардиальной полости личинок земляного шмеля, позволили определить наличие участков, представляющих скопление довольно крупных клеток (до 9мкм), с относительно слабо конденсированным хроматином в ядре. По морфологическим особенностям они сходны с фрагментами гемоцитотворной ткани тополевого пилильщика (Запольских, 1979). Такие клетки способны к активному митотическому делению и, по-видимому, являются предшественниками прогемоцитов. Клетки, обнаруженных фрагментов кроветворной ткани морфологически однородны и могут быть определены как гемоцитобласты. При дальнейшем их развитии образуются прогемоциты, которые отличаются меньшими размерами (6.5−7.5 мкм) и более высокой степенью базофильности цитоплазмы. Клетки имеют довольно крупное ядро. У прогемоцитов личинок хроматин ядра мелкозернистый, у куколок и имаго хроматин выявляется иногда в виде плотного клубка. В цитоплазме прогемоцитов шмелей обнаружено высокое содержание РНК и белка, жировые капли и включения гликогена не встречаются.

Прогемоциты циркулирующие в гемолимфе, сохраняют способность к митозу и дальнейшей дифференциации. Число делящихся прогемоцитов составляет у личинок 1 возраста 5−6%, затем наблюдается снижение митотической активности до 3−4% у личинок 3 возраста и до 2% у белых куколок. На стадии имаго митотический индекс равен 1%. В гемолимфе шмеля, особенно у личинок ранних возрастов, можно наблюдать образование скоплений молодых гемоцитов, содержащих делящиеся прогемоциты и клетки, находящиеся на разных стадиях дифференциации. Наличие большого количества промежуточных форм между прогемоцитами и другими группами дифференцированных гемоцитов, позволяет считать их источником развития всех специализированных клеток гемолимфы. Наши наблюдения вполне согласуются с предположением о происхождении всех типов гемоцитов от единой первоначальной клетки (Price and Ratcliffe, 1974). Исследование процессов формирования зрелых клеток гемолимфы у личинок шмеля показало, что дифференциация гемоцитов происходит в двух направлениях с развитием нескольких линий клеток. Схема дифференциации гемоцитов личинок и белых куколок представлена на рисунке 1.

Первое направление связано с образованием двух линий клеток: микрофагоцитов и сферулоцитов (рис. 1, в, г). Микрофагоциты представляют собой наиболее мелкие фагоциты личинок и белых куколок шмеля, длина их клетки не превышает 10.5 мкм. Для дифференциации микрофагоцитов характерно изменение конденсации хроматина в ядре, который представлен относительно крупными хроматиновыми глыбками, и изменение формы клетки, она становится овальной или веретеновидной. В цитоплазме появляются вакуоли, их содержимое дает положительную реакцию на белки и полисахариды, иногда обнаруживаются жировые включения.

При образовании сферулоцитов в околоядерной области цитоплазмы, формируются две или три сферические вакуоли с белковым содержимым или белковыми гранулами. Накопление массы цитоплазмы сферулоцитов идет постепенно, одновременно с процессами дифференциации, поэтому у молодых сферулоцитов, имеющих небольшую величину, уже появляются сферические вакуоли, размеры которых увеличиваются пропорционально размерам клетки. Хроматин ядра принимает нитевидную структуру, хроматиновые глыбки четко не просматриваются. У зрелых сферулоцитов ядро смещается и, обычно, расположено эксцентрично. В конце развития личинки сферулоциты исчезают и в гемолимфе предкуколок не обнаруживаются.

При другом направлении развития прогемоцитов личинок и белых куколок происходит формирование макронуклеоцитов (рис. 1, б), которые в гемолимфе личинок составляют довольно многочисленную группу клеток. Макронуклеоциты представляют собой клетки с крупным ядром и относительно небольшим объемом цитоплазмы. Появление в гемолимфе макронуклеоцитов связано с интенсивностью процессов дифференциации клеток. Существует предположение о том, что у разных насекомых длительность процессов развития прогемоцитов различна, например, у пчел и муравьев развитие прогемоцитов идет быстрыми темпами и молодые формы специализированных гемоцитов уже имеют заметные характерные особенности, позволяющие выделять их как определенный тип клеток. У личинок земляного шмеля, прогемоциты, вступившие на путь дифференцировки, сохраняя малую степень дифференциации, заметно увеличиваются в размерах и переходят в следующую стадию развития — макронуклеоциты, которые в дальнейшем образуют ряд специализированных клеток гемолимфы. Такая поздняя дифференциация характерна для тех гемоцитов, которые должны иметь к началу дифференциации значительный объем цитоплазмы (Запольских, 1987).

Рис. 1. Схема дифференциации гемоцитов личинок и белых куколок шмеля B. terestris (увел. об.40, ок.15)

гемолимфа клеточный шмель постэмбриональный Прогемоциты (а), макронуклеоциты (б), микрофагоциты (в), сферулоциты (г), веретеновидные фагоциты (д), амебоидные фагоциты (е), эноцитоиды (ж), макрофагоциты (з).

Изучение морфологии макронуклеоцитов личинок и белых куколок земляного шмеля показало, что они сохраняют признаки малой дифференциации: ядерно-цитоплазматическое соотношение, характерное для прогемоцитов, плотно-зернистую структуру хроматина, интенсивную базофилию клетки, свидетельствующую о высокой концентрации РНК, способность к митотическому делению. Митотический индекс макронуклеоцитов равен 1−2%. Эти особенности морфологии макронуклеоцитов, общие для всей системы малодифференцированных гемоцитов, позволяют отнести их в группу пролиферирующих клеток. Но по сравнению с прогемоцитами, макронуклеоциты имеют более высокую степень дифференциации, на это указывает появление в цитоплазме вакуолей, содержащих полисахариды и липиды, а также наличие способности к образованию цитоплазматических отростков, определяющих фагоцитарные функции. Дальнейшая дифференциация макронуклеоцитов личинок приводит к образованию двух типов гемоцитов: фагоцитов и эноцитоидов (рис. 1, в, д, ж). Макронуклеоциты образуют при дифференциации веретеновидные и амебоидные фагоциты.

Для дифференцирующихся фагоцитов личинок и белых куколок характерно изменение формы и размеров клеток. Веретеновидные фагоциты приобретают удлиненную форму, с двумя цитоплазматическими отростками, длина и форма которых может быть различна. Длина клетки достигает 16 мкм. Форма амебоидных фагоцитов более разнообразна и определяется количеством и формой многочисленных цитоплазматических отростков. Зрелые клетки крупные, около 18 мкм в диаметре.

В ходе дифференциации фагоцитов ядро приобретает зернистую структуру, с немногочисленными хроматиновыми глыбками и тремя ядрышками. В цитоплазме формируется система вакуолей, особенно хорошо развитая у амебоидных фагоцитов. Большая часть мелких вакуолей расположена в периферической области клетки, где они собраны в группы. Содержимое вакуолей дает положительную реакцию на белки, иногда обнаруживаются полисахариды. В зрелых фагоцитах наблюдается появление гранул гликогена. Постоянными компонентами цитоплазмы являются жировые капли, более крупные у амебоидных фагоцитов, они обнаруживаются, в основном, в периферических частях цитоплазмы, где также сконцентрированы сложные белковые комплексы в виде липопротеидов и гликопротеидов. В гемолимфе белых куколок земляного шмеля в результате дифференциации макронуклеоцитов образуется особый класс фагоцитов — макрофагоциты (рис. 1, е), которые не встречаются в гемолимфе личинок. Макрофагоциты были обнаружены у ряда насекомых и определены как клетки участвующие в гистолизе личиночных тканей (Запольских, 1979). Молодые макрофагоциты имеют округлую или овальную форму, зрелые клетки приобретают амебоидную форму, с короткими и мощными цитоплазматическими отростками. У зрелых клеток небольшое мелкозернистое ядро часто располагается эксцентрично и не всегда хорошо просматривается в интенсивно окрашенной цитоплазме. В процессе дифференциации и роста клетки происходит накопление в цитоплазме большого количества белково-углеводных и жировых включений. В ходе роста макрофагоциты могут достигать 40 мкм в диаметре.

В процессе дифференциации эноцитоидов (рис. 1, з), которые встречаются только в гемолимфе личинок шмеля B. terrestris, наблюдается довольно характерное изменение структуры ядра. У молодых эноцитоидов ядро занимает центральную часть клетки, хроматин конденсируется в глыбки овальной формы, расположенные в ядре равномерно. У зрелых клеток глыбки четко выражены, их число не менее 14. В цитоплазме молодых эноцитоидов обнаруживается высокое содержание РНК, которое снижается в процессе дифференциации клетки и остается высоким лишь в периферической области. Перинуклеарное пространство эноцитоидов слабо окрашивается азур-эозином, вероятно здесь, как и у большинства перепончатокрылых насекомых, сконцентрированы органоиды: митохондрии и аппарат Гольджи. (Devauchelle, 1971). В периферической зоне цитоплазмы эноцитоидов начинают накапливаться мелкие вакуоли, которые постепенно заполняют всю цитоплазму, в их содержимом выявляются белки. Жировые включения в цитоплазме эноцитоидов отсутствуют. Встречаются мелкие зерна гликогена, изредка белковые гранулы.

Изучение состава гемоцитов куколок и имаго земляного шмеля показало, что в гемолимфе темной куколки происходит полная смена личиночных гемоцитов на имагинальные. Дифференциация гемоцитов имаго шмеля представлена на рисунке 2.

Рис. 2. Схема дифференциации гемоцитов имаго B. terrestris (увел. об.40, ок.15): прогемоциты (а), нейтрофильные фагоциты (б), сферулоциты (в).

На схеме видно, что у имаго земляного шмеля прогемоциты (рис 2, а) являются источником развития двух типов клеток гемолимфы: фагоцитов и сферулоцитов. Макронуклеоциты, выявленные в гемолимфе личинок, у имаго не обнаруживаются, что связано с более высокой скоростью процессов дифференциации прогемоцитов и образования специализированных клеток у имаго, по сравнению с личинками. С быстро протекающими процессами диференциации прогемоцитов возможно связано уменьшение митотического индекса у имаго до 1%. Вероятно, у имаго регенерация прогемоцитов обеспечивается в большей степени клетками кроветворной ткани. Для дифференцирующихся фагоцитов и сферулоцитов имаго шмеля по существу характерны те же изменения структуры, какие мы наблюдали у соответствующих типов гемоцитов личинок.

Таким образом, изменение количественного соотношения форменных элементов крови связано с процессами их образования и дифференциации. Общим источником развития специализированных клеток гемолимфы у шмелей является система малодифференцированных клеток, что характерно и для других групп животных. Увеличение числа клеток гемолимфы может происходить как за счет образования новых клеток в кроветворных органах, так и путем митотического деления малодифференцированных гемоцитов в циркулирующей гемолимфе. Данные процессы способствуют сохранению постоянного состава гемоцитов на уровне, необходимом для нормальной жизнедеятельности организма и адаптации его к изменению условий окружающей среды.