ΠΠΈΠ·ΡΠ°Π»ΠΈΠ·Π°ΡΠΈΡ ΡΠ΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°ΡΠΎΠ² ΠΠ¦Π ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ΠΎΠΌ ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π·Π° Π½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΈΠ½ΠΎΠ²ΡΡ ΠΊΠΈΡΠ»ΠΎΡ Π² 1, 5% Π°Π³Π°ΡΠΎΠ·Π½ΠΎΠΌ Π³Π΅Π»Π΅ (Maniatis, 1982)
ΠΠΎΡΠΎΠ²ΠΈΠ»ΠΈ 1,5%-Π½ΡΠΉ Π°Π³Π°ΡΠΎΠ·Π½ΡΠΉ Π³Π΅Π»Ρ Ρ Π»ΡΠ½ΠΊΠ°ΠΌΠΈ Π΄Π»Ρ Π²Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ ΠΏΡΠΎΠ±. ΠΠ»Ρ ΡΡΠΎΠ³ΠΎ 1,5 Π³ Π°Π³Π°ΡΠΎΠ·Ρ ΡΠ°Π·Π²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ Π² 100 ΠΌΠ» ΡΠ°Π±ΠΎΡΠ΅Π³ΠΎ ΡΡΠΈΡ-Π°ΡΠ΅ΡΠ°ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° (24,2 Π³ ΡΡΠΈΡ-(Π³ΠΈΠ΄ΡΠΎΠΊΡΠΈ)Π°ΠΌΠΈΠ½ΠΎΠΌΠ΅ΡΠ°Π½Π°, 5,7 ΠΌΠ» Π»Π΅Π΄ΡΠ½ΠΎΠΉ ΡΠΊΡΡΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΠΈΡΠ»ΠΎΡΡ, 10 ΠΌΠ» 0,5 Π ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° ΡΡΠΈΠ»Π΅Π½Π΄ΠΈΠ°ΠΌΠΈΠ½ΠΎΡΠ΅ΡΡΠ°ΡΠΊΡΡΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΠΈΡΠ»ΠΎΡΡ, pH 8.0) ΠΈ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»ΡΠ»ΠΈ 10ΠΌΠΊΠ» 10%-Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π²ΠΎΠ΄Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° Π±ΡΠΎΠΌΠΈΠ΄Π° ΡΡΠΈΠ΄ΠΈΡ. Π‘ΡΡΠΏΠ΅Π½Π·ΠΈΡ Π½Π°Π³ΡΠ΅Π²Π°Π»ΠΈ Π½Π° Π²ΠΎΠ΄ΡΠ½ΠΎΠΉ Π±Π°Π½Π΅ Π΄ΠΎ ΠΏΠΎΠ»Π½ΠΎΠ³ΠΎ… Π§ΠΈΡΠ°ΡΡ Π΅ΡΡ >
ΠΠΈΠ·ΡΠ°Π»ΠΈΠ·Π°ΡΠΈΡ ΡΠ΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°ΡΠΎΠ² ΠΠ¦Π ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ΠΎΠΌ ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π·Π° Π½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΈΠ½ΠΎΠ²ΡΡ ΠΊΠΈΡΠ»ΠΎΡ Π² 1, 5% Π°Π³Π°ΡΠΎΠ·Π½ΠΎΠΌ Π³Π΅Π»Π΅ (Maniatis, 1982) (ΡΠ΅ΡΠ΅ΡΠ°Ρ, ΠΊΡΡΡΠΎΠ²Π°Ρ, Π΄ΠΈΠΏΠ»ΠΎΠΌ, ΠΊΠΎΠ½ΡΡΠΎΠ»ΡΠ½Π°Ρ)
ΠΠΎΡΠΎΠ²ΠΈΠ»ΠΈ 1,5%-Π½ΡΠΉ Π°Π³Π°ΡΠΎΠ·Π½ΡΠΉ Π³Π΅Π»Ρ Ρ Π»ΡΠ½ΠΊΠ°ΠΌΠΈ Π΄Π»Ρ Π²Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ ΠΏΡΠΎΠ±. ΠΠ»Ρ ΡΡΠΎΠ³ΠΎ 1,5 Π³ Π°Π³Π°ΡΠΎΠ·Ρ ΡΠ°Π·Π²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ Π² 100 ΠΌΠ» ΡΠ°Π±ΠΎΡΠ΅Π³ΠΎ ΡΡΠΈΡ-Π°ΡΠ΅ΡΠ°ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° (24,2 Π³ ΡΡΠΈΡ-(Π³ΠΈΠ΄ΡΠΎΠΊΡΠΈ)Π°ΠΌΠΈΠ½ΠΎΠΌΠ΅ΡΠ°Π½Π°, 5,7 ΠΌΠ» Π»Π΅Π΄ΡΠ½ΠΎΠΉ ΡΠΊΡΡΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΠΈΡΠ»ΠΎΡΡ, 10 ΠΌΠ» 0,5 Π ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° ΡΡΠΈΠ»Π΅Π½Π΄ΠΈΠ°ΠΌΠΈΠ½ΠΎΡΠ΅ΡΡΠ°ΡΠΊΡΡΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΠΈΡΠ»ΠΎΡΡ, pH 8.0) ΠΈ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»ΡΠ»ΠΈ 10ΠΌΠΊΠ» 10%-Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π²ΠΎΠ΄Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° Π±ΡΠΎΠΌΠΈΠ΄Π° ΡΡΠΈΠ΄ΠΈΡ. Π‘ΡΡΠΏΠ΅Π½Π·ΠΈΡ Π½Π°Π³ΡΠ΅Π²Π°Π»ΠΈ Π½Π° Π²ΠΎΠ΄ΡΠ½ΠΎΠΉ Π±Π°Π½Π΅ Π΄ΠΎ ΠΏΠΎΠ»Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ΅Π½ΠΈΡ Π°Π³Π°ΡΠΎΠ·Ρ, ΠΏΠ΅ΡΠΈΠΎΠ΄ΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠ΅ΡΠΈΠ²Π°Ρ. Π Π°ΡΡΠ²ΠΎΡΡ Π΄Π°Π²Π°Π»ΠΈ ΠΎΡΡΡΡΡ ΠΏΡΠΈΠΌΠ΅ΡΠ½ΠΎ Π΄ΠΎ 50? Π‘ ΠΈ Π·Π°Π»ΠΈΠ²Π°Π»ΠΈ Π² ΡΠΎΡΠΌΡ Π΄Π»Ρ Π°Π³Π°ΡΠΎΠ·Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π±Π»ΠΎΠΊΠ°, Π²ΡΡΠ°Π²Π»ΡΠ»ΠΈ Π³ΡΠ΅Π±Π΅Π½ΠΊΡ Π΄Π»Ρ ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ Π»ΡΠ½ΠΎΠΊ ΠΈ Π΄Π°Π²Π°Π»ΠΈ Π°Π³Π°ΡΠΎΠ·Π΅ Π·Π°ΡΡΡΡΡ Π΄ΠΎ ΡΠΎΡΡΠΎΡΠ½ΠΈΡ Π³Π΅Π»Ρ.
ΠΠ·-ΠΏΠΎΠ΄ ΡΠ»ΠΎΡ ΠΌΠ°ΡΠ»Π° ΠΎΡΠ±ΠΈΡΠ°Π»ΠΈ 10 ΠΌΠΊΠ» ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° Π°ΠΌΠΏΠ»ΠΈΡΠΈΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π½ΠΎΠΉ ΠΠΠ ΠΈ ΡΠΌΠ΅ΡΠΈΠ²Π°Π»ΠΈ Ρ 10 ΠΌΠΊΠ» Π±ΡΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° Π΄Π»Ρ Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ ΠΏΡΠΎΠ± (50% Π³Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠΈΠ½Π°, 0,25% Π±ΡΠΎΠΌΡΠ΅Π½ΠΎΠ»ΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΈΠ½Π΅Π³ΠΎ Π² Π΄ΠΈΡΡΠΈΠ»Π»ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π½ΠΎΠΉ Π²ΠΎΠ΄Π΅). ΠΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½Π½ΡΡ ΡΠΌΠ΅ΡΡ ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΎΡΠΈΠ»ΠΈ Π² Π»ΡΠ½ΠΊΠΈ Π³Π΅Π»Ρ. ΠΠ°ΠΌΠ΅ΡΡ Π΄Π»Ρ ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π·Π° «Helicon» (Π³. ΠΠΎΡΠΊΠ²Π°) ΠΏΠΎΠ΄ΠΊΠ»ΡΡΠ°Π»ΠΈ ΠΊ ΠΈΡΡΠΎΡΠ½ΠΈΠΊΡ ΠΏΠΈΡΠ°Π½ΠΈΡ «ΠΠ»ΡΡ-2» (Π ΠΎΡΡΠΈΡ), ΡΠΎΠ±Π»ΡΠ΄Π°Ρ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ½ΠΎΡΡΡ. ΠΡΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π· Π² ΡΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ 15 ΠΌΠΈΠ½ΡΡ ΠΏΡΠΈ Π½Π°ΠΏΡΡΠΆΠ΅Π½ΠΈΠΈ 200 Π²ΠΎΠ»ΡΡ (ΠΊΡΠ°ΡΠΈΡΠ΅Π»Ρ Π΄ΠΎΠ»ΠΆΠ΅Π½ ΠΏΡΠΎΠΉΡΠΈ Π½Π΅ ΠΌΠ΅Π½Π΅Π΅ 2 ΡΠΌ Π³Π΅Π»Ρ). ΠΡΠΊΠ»ΡΡΠ°Π»ΠΈ ΡΠΎΠΊ. ΠΠΎΠΌΠ΅ΡΠ°Π»ΠΈ Π³Π΅Π»Ρ Π² ΠΎΠΊΠ½ΠΎ ΡΡΠ°Π½ΡΠΈΠ»Π»ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡΠ° «Biokom UVT-1» (Π€ΡΠ°Π½ΡΠΈΡ). Π Π΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°Ρ ΡΠ΅Π³ΠΈΡΡΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ Ρ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ ΡΠΈΡΡΠ΅ΠΌΡ Π²ΠΈΠ΄Π΅ΠΎΠ΄ΠΎΠΊΡΠΌΠ΅Π½ΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ «VITRan».
ΠΡΡΠΌΠΎΠ΅ ΠΎΠΏΡΠ΅Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ Π½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Π½ΠΎΠΉ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΠΈ
ΠΠ»Ρ ΠΎΠΏΡΠ΅Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΡ Π½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Π½ΠΎΠΉ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΠΈ ΡΡΠ°Π³ΠΌΠ΅Π½ΡΡ ΠΊΠΠΠ Π²ΡΡΠ΅Π·Π°Π»ΠΈ ΠΈΠ· Π°Π³Π°ΡΠΎΠ·Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π³Π΅Π»Ρ Ρ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΡΡΡΠ΅ΠΉ ΡΠ»ΡΡΠΈΠ΅ΠΉ ΠΈ ΠΎΡΠΈΡΠ°Π»ΠΈ Ρ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π½Π°Π±ΠΎΡΠ° DNA Extraction Kit («Fermentas», ΠΠ°ΡΠ²ΠΈΡ) ΡΠΎΠ³Π»Π°ΡΠ½ΠΎ ΡΠ΅ΠΊΠΎΠΌΠ΅Π½Π΄Π°ΡΠΈΡΠΌ ΠΏΡΠΎΠΈΠ·Π²ΠΎΠ΄ΠΈΡΠ΅Π»Ρ. Π Π΅Π°ΠΊΡΠΈΡ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ Π΄ΠΈΠ΄Π΅Π·ΠΎΠΊΡΠΈΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΠ·ΠΈΠ΄ΡΡΠΈΡΠΎΡΡΠ°ΡΠ°ΠΌΠΈ, ΠΌΠ΅ΡΠ΅Π½Π½ΡΠΌΠΈ ΡΠ»ΡΠΎΡΠ΅ΡΡΠ΅Π½ΡΠ½ΡΠΌΠΈ ΠΊΡΠ°ΡΠΈΡΠ΅Π»ΡΠΌΠΈ, ΠΏΡΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ Ρ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π½Π°Π±ΠΎΡΠ° BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit («Applied Biosystems», USA). Π 5 ΠΌΠΊΠ» ΠΠΠ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»ΡΠ»ΠΈ 1 ΠΌΠΊΠ» BigDye Terminator, 2 ΠΌΠΊΠ» Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° ΠΈ 0.5 ΠΌΠΊΠ» ΠΏΡΠ°ΠΉΠΌΠ΅ΡΠ°, ΠΈΠ½ΠΊΡΠ±ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΏΡΠΈ 94Π‘ Π² ΡΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ 5 ΠΌΠΈΠ½ ΠΈ ΠΏΡΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ 25 ΡΠΈΠΊΠ»ΠΎΠ² ΠΠ¦Π ΠΏΠΎ ΡΠ»Π΅Π΄ΡΡΡΠ΅ΠΉ ΠΏΡΠΎΠ³ΡΠ°ΠΌΠΌΠ΅: 94Π‘ — 10 ΡΠ΅ΠΊ, 50Π‘ — 10 ΡΠ΅ΠΊ, 62 — 4 ΠΌΠΈΠ½. Π Π΅Π°ΠΊΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΡ ΡΠΌΠ΅ΡΡ ΠΏΠ΅ΡΠ΅ΠΎΡΠ°ΠΆΠ΄Π°Π»ΠΈ ΠΈΠ·ΠΎΠΏΡΠΎΠΏΠ°Π½ΠΎΠ»ΠΎΠΌ, ΡΠ°Π·Π²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ Π² 20 ΠΌΠΊΠ» Π΄Π΅ΠΈΠΎΠ½ΠΈΠ·ΠΎΠ²Π°Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΎΡΠΌΠ°ΠΌΠΈΠ΄Π° ΠΈ ΠΏΡΠΎΠ³ΡΠ΅Π²Π°Π»ΠΈ ΠΏΡΠΈ 94Π‘ Π² ΡΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ 5 ΠΌΠΈΠ½. ΠΠ°ΡΠ΅ΠΌ ΠΏΡΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ· Π½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Π½ΠΎΠΉ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΠΈ ΠΎΠ΄Π½ΠΎΡΠ΅ΠΏΠΎΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΠΠ Ρ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π³Π΅Π½Π΅ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠ³ΠΎ Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ·Π°ΡΠΎΡΠ° ABI Prizm 3130 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», USA).