Материалы и методы исследования
Удаляем супернатант, к осадку добавляем 1 мл рабочего раствора солевого буфера, перемешиваем, центрифугируем десять секунд при 5000 об. Осторожно, не задевая осадка, удаляем супернатант с помощью водоструйного насоса. К осадку прибавляем 200 мкл лизирующего раствора. Удаляем супернатант. Убираем полосками фильтровальной бумаги остатки жидкости над сорбентом, меняя полоски от пробы к пробе. При… Читать ещё >
Материалы и методы исследования (реферат, курсовая, диплом, контрольная)
Материал исследования
Исследование проводилось в 2014 году в период с 17.06.14 по 27.07.14 и с 02.09.14 по 12.10.14. В лаборатории биотехнологии генотипировано 100 голов быков — производителей голштинской черно-пестрой породы, принадлежащих различным племенным предприятиям: ОАО «ГЦВ», ОАО «Московское» по племенной работе, ОАО «Краснодарское» по племенной работе, ГУПП РК «Карелиягосплем», ОАО «Невское» по племенной работе и ОАО «Племпредприятие «Череповецкое», рожденные во временном интервале с 1982 по 2012 года.
В качестве материала для выделения ДНК служила сперма быков-производителей.
Источниками информации о происхождении и оценке быков-производителей стали их племенные свидетельства и данные каталогов племпредприятий.
Выделение ДНК
При выделении ДНК из спермы нами использовались наборы реагентов Diatom™ DNA Prep 100 ООО Лаборатория «Изоген» г. Москва.
- 1. Первичная обработка образцов.
- — Семя размораживаем. 100 мкл переносим в чистую пробирку, добавляем 240 мкл лизирующего раствора (Lysisreagent), 20 мкл ДТТ на каждые 10 проб, термостатируем смесь при 65? С 40 мин. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин. Переносим супернатант в чистую пробирку.
- — К 100 мкл крови добавляем 400 мкл лизирующего раствора (Lysisreagent). Приступаем к выделению без термостатирования.
- 2. В пробирку с лизатом добавляем 20 мкл суспензии сорбента (диатомовые водоросли). Перед этим сорбент встряхиваем на вортексе. Ротируем 10 мин.
- 3. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин.
- 4. Осторожно, не задевая осадка, удаляем супернатант с помощью водоструйного насоса. К осадку прибавляем 200 мкл лизирующего раствора.
- 5. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин.
- 6. Удаляем супернатант. К осадку добавляем 1 мл рабочего однократного раствора солевого буфера (десятикратный солевой буфер (1М хлорид натрия (NaCl) и 1M хлорид калия (KCl)) разводим водой до 100 мл, а затем 96% этиловым спиртом до 300 мл и перемешиваем).
- 7. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин.
- 8. Удаляем супернатант, к осадку добавляем 1 мл рабочего раствора солевого буфера, перемешиваем, центрифугируем десять секунд при 5000 об.
- 9. Удаляем супернатант. Убираем полосками фильтровальной бумаги остатки жидкости над сорбентом, меняя полоски от пробы к пробе.
- 10. Осадок сушим в термостате при 65? С пять минут.
- 11. К осадку добавляем 100 мкл ЭкстраГена (10% смесь ионообменников (типа Chelex), и 0,01% тритон X-100). Пробирку с ЭкстраГеном хорошо перемешать. Затем ресуспендируем на вортексе и термостатируем пять минут при 65? С.
- 12. Центрифугируем при 12 000 об/мин
- 13. Перенести содержащую ДНК надосадочную жидкость (80 мкл) в чистую пробирку.
Выход ДНК составлял 3−5 мгк/100 мкл с OD 260/280 от 1,6 до 2,0.