Модифицирующее влияние экспозиции в запахе различных одорантов на обонятельную чувствительность грызунов

Эксперименты по экспозиции грызунов в атмосфере запаха показывают, что экспозиция в атмосфере какого-либо одоранта приводит к повышению чувствительности к этому веществу (Voznesenskaya, Wysocki, 1995, 1998; Voznesenskaya et al., 1998). В основе этого феномена лежит, как частный случай, по-видимому, появление новых рецепторов, специфичных к данному типу раздражителя. Проводя подобные эксперименты, мы ставили перед собой задачу установить, является ли данное повышение обонятельной чувствительности общей закономерностью, проследить характер изменения чувствительности в процессе экспозиции и осуществить попытку выявления механизмов данного изменения обонятельной чувствительности. Были осуществлены эксперименты по экспозиции в атмосфере изовалериановой кислоты (ИВК), изоамилацетата (ИАА) и камфоры с одновременным определением порогов к ИВК. Выбор ИВК в качестве обонятельного стимула обусловлен ее предполагаемой биологической ролью. Это летучее вещество входит в состав мочи домовых мышей и серых крыс в пределах от 0 до 33.8% от общей суммы обнаруженных кислот и играет, по-видимому, важную роль в химической коммуникации грызунов (Зинкевич, Курятов, 1979; Соколов и др., 1980). В свою очередь, ИАА и камфора могут быть отнесены к группе неспецифических запаховых раздражителей, не несущих для животных смысловой нагрузки.

Материалы и методы исследования. Эксперимент проводили на половозрелых самцах и самках белых лабораторных нелинейных мышей. Были взяты 25 половозрелых самок мышей в возрасте 2 месяца (первая группа), 15 половозрелых самок в возрасте 6 месяцев (вторая группа) и 20 половозрелых самцов в возрасте 5 месяцев (третья группа). Животные первой группы были на 4 недели помещены в клетки с повышенным содержанием в атмосфере ИАА. Пороги восприятия ИВК определяли через 7, 10, 14 и 28 дней экспозиции. Животные второй группы на 2 недели помещались в клетки с повышенным содержанием в атмосфере камфоры. Пороги восприятия ИВК определяли через 7 и 10 дней экспозиции. Животные третьей группы на 7 недель помещались в атмосферу с повышенным содержанием ИВК. Пороги восприятия ИВК определяли через 7, 14, 21, 28, 35 и 42 дня экспозиции. Перед началом выдерживания для всех групп было проведено контрольное тестирование.

Опыты осуществляли на основе условнорефлекторной методики с подкреплением электрическим током (70V, 10 мсек, 99 импульсов в секунду). В эксперименте применяли концентрационный ряд растворов ИВК (10^-3-10^-9.5 моль/л). Для самок ежедневно определяли стадию эстрального цикла путем взятия мазков из влагалища с последующим микроскопированием стандартными методами.

Полученные в ходе эксперимента результаты были подвергнуты статистической обработке с использованием специализированных статистических пакетов (Microsoft Exсel, Statistica) и оригинальных программ. Достоверность различий двух выборок определялась по критерию Уилкоксона, задача суммарной оценки влияния фактора выполнялась с помощью непараметрического аналога однофакторного дисперсионного анализа по Краскелу — Уоллису (Тюрин, Макаров, 1995).

Результаты и их обсуждение. Ранее нами было показано, что обонятельная чувствительность снижается с возрастом, однако повышение порогов восприятия одорантов в течение 1−1.5 месяцев является недостоверным (Мельник, Носова, 2000). Такое допущение является необходимым при проведении длительных исследований.

Полученные по экспозиции в атмосфере ИАА данные свидетельствуют об увеличении обонятельной чувствительности к запаху ИВК у тестируемых животных. Снижение порогов чувствительности к ИВК происходит к седьмому дню выдерживания в ИАА. Далее чувствительность остается постоянной до конца эксперимента на стадии эструса и незначительно повышается к десятому дню на стадии проэструса (рис.1). Здесь и далее lg C — логарифм концентрации.

Достоверность влияния фактора выдерживания в ИАА на обонятельную чувствительность к запаху ИВК оценивали путем однофакторного анализа по Краскелу-Уоллису.

Фактор экспозиции в атмосфере запаха изоамилацетата достоверно влияет на пороги восприятия самками мышей изовалериановой кислоты. Влияние достоверно по второму порогу доверительной вероятности (P < 0.01) для стадий эструса, метэструса и диэструса, и по первому порогу — для стадии проэструса (P < 0.05). Сила влияния имеет наименьшее значение для стадии проэструса, наибольшее — для стадии диэструса.

Была проведена оценка статистической значимости различий порогов восприятия ИВК по стадиям эстрального цикла при разных сроках выдерживания животных в атмосфере запаха ИАА. Для снятия «эффекта множественных сравнений» расчет велся по критерию Данна. Установлено, что животные группы контроля имеют достоверные различия в порогах восприятия ИВК для всех стадий эстрального цикла. Тестирование на 7-й день экспозиции в атмосфере запаха ИАА показало выравнивание обонятельной чувствительности к ИВК для разных стадий цикла (рис.1). В дальнейшем происходит частичное восстановление различий порогов восприятия ИВК — на 10-й день выдерживания в атмосфере ИАА начинают отличаться проэструс и диэструс, а на 28-й день порог чувствительности в метэструсе повышается, что характерно для интактных животных (чувствительность становится достоверно ниже, чем в проэструсе).

В целом, достоверное повышение чувствительности к ИВК происходит в течение первой недели экспозиции в атмосфере запаха изоамилацетата. Далее она выходит на плато.

Результаты эксперимента по экспозиции в атмосфере запаха камфоры показали повышение обонятельной чувствительности к запаху ИВК для отдельных стадий эстрального цикла, наблюдаемого к концу первой недели экспозиции. Далее чувствительность становится постоянной, и ее увеличения, равно как и снижения, не происходит (рис.2).

Экспозиция в атмосфере камфоры оказывает достоверное влияние на обонятельную чувствительность к запаху ИВК половозрелых самок мышей. Выдерживание в атмосфере запаха камфоры влечет за собой снижение порогов восприятия запаха ИВК в эструсе и метэструсе. Кроме того, выдерживание в запахе камфоры привело к выравниванию обонятельной чувствительности к ИВК для разных стадий.

Рис. 2. Изменение обонятельной чувствительности мышей в возрасте 6 месяцев к ИВК при экспозиции в атмосфере запаха камфоры

Экспозиция в атмосфере ИВК половозрелых самцов мышей приводит к сходным результатам. Уже первое тестирование спустя 7 дней после начала эксперимента показало достоверное увеличение обонятельной чувствительности к запаху ИВК (-8.69±0.11 моль/л у тестируемых животных и — 8.46±0.11 моль/л у животных до начала эксперимента соответственно, P < 0.05). В течение четырех недель происходит монотонное снижение порогов восприятия ИВК, далее чувствительность стабилизируется (рис.3).

Рис. 3. Изменение обонятельной чувствительности мышей в возрасте 5 месяцевк ИВК при экспозиции в атмосфере запаха ИВК

Результаты, отчасти сопоставимые с приведенными выше, были получены нами ранее при выдерживании половозрелых самцов нелинейных лабораторных мышей в атмосфере запаха камфоры (Мельник и др., 2001), однако в качестве запахового стимула, на который вырабатывали условный рефлекс избегания, использовали не ИВК, а камфору.

У животных, подвергавшихся воздействию камфоры, было отмечено понижение порогов восприятия этого вещества немного больше, чем на порядок. Чувствительность к запаху камфоры изменялась в течение первых четырех недель, максимальное снижение порогов восприятия данного одоранта было выявлено в течение третьей недели эксперимента, далее чувствительность оставалась постоянной (Мельник и др., 2001).

Анализ полученных результатов показал достоверное уменьшение порогов восприятия раствора камфоры (P < 0.05), но в случае предварительной обработки сульфатом цинка величина изменений достигает больших значений. По-видимому, различия в этих двух группах связаны с тем, что в первые две недели у самцов с разрушенным обонятельным эпителием происходит резкое увеличение числа рецепторных клеток по сравнению с интактными животными. Это обуславливает резкий рост обонятельной чувствительности и связано, вероятно, с тем, что именно в течение первой-второй недель происходит максимальное увеличение числа рецепторных клеток, их рост, дифференцировка и образование первых связей с обонятельной луковицей (Gesteland et al., 1982). Изменения обонятельной чувствительности у мышей с выстилкой, разрушенной сульфатом цинка, выдержанных в атмосфере запаха камфоры, сходны с таковыми у неполовозрелых мышей по отношению к ИВК (Мельник, Носова, 1999; 2000); особи в возрасте трех недель обладают наименьшими порогами восприятия ИВК. Очевидно, что экспериментальная аносмия приводит к процессу, во многом сходному с эмбриональными и постэмбриональными изменениями в органе обоняния.

Результаты проведенных нами экспериментов показывают, что экспозиция в запаховой атмосфере приводит к повышению обонятельной чувствительности к ИВК вне зависимости от природы действующего одоранта как у самцов, так и у самок. У самок, кроме того, мы наблюдаем в той или иной степени выраженное сглаживание чувствительности для разных стадий эстрального цикла, т. е. понижение величин порогов на различных стадиях полового цикла до минимальной величины, характерной для проэструса. Общее повышение чувствительности связано с общим адаптационным механизмом, в основе которого, по-видимому, лежит модуляция ионных каналов — цАМФ-каналов и кальциевых ионных каналов посредством Са²⁺ (Zylinska et al., 1999). В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что происходит быстрое снижение порогов восприятия ИВК в течение первой недели экспозиции. Менее вероятным является утверждение о неспецифическом образовании новых рецепторных структур, вызванном усилением экспрессии генов в целом. Такой механизм более вероятен для самцов, поскольку в течение достаточно длительного времени происходит монотонное повышение чувствительности. Тем не менее, вопрос о степени избирательности обонятельных рецепторов представляет большой интерес.

Используемые нами вещества (изоамилацетат и камфора) вызвали неспецифическое повышение чувствительности к изовалериановой кислоте. Однако результаты наших экспериментов не противоречат гипотезе о специфичности и избирательности обонятельных рецепторных клеток.

Искусственные пахучие вещества (камфора, ацетат, изоамилацетат) вызывают специфические сдвиги даже в клетках нейробластомы мышей, которые явно не должны содержать специфических хеморецепторов (Kashiwayanagy, Kurihara, 1985). По мнению Я. А. Винникова (1991) эти соединения вообще не должны приниматься в расчет при построении гипотез в изучении обонятельной хеморецепции, поскольку они, по-видимому, не имеют биологического значения. Тем не менее, в ходе экспериментов, проведенных на крысах (Duchamp-Viret et al., 1998), показана высокая чувствительность нейрорецепторных клеток к чистым химическим одорантам, а исследования по выяснению степени селективности этой чувствительности проводятся в настоящее время. Предполагается существование наряду с высокоспециализированными рецепторными клетками и поливалентных. В свете этих представлений находит объяснение описанное нами выше повышение чувствительности к естественному одоранту (ИВК) при экспозиции в ИАА и камфоре.

экспозиция грызун запах обонятельная чувствительность.