Морфология и химический состав вирусов. 
Отличие вирусов от других организмов. 
Методы культивирования вирусов. 
Культуры клеток и их характеристика

Первооткрывателем вирусов, основоположником вирусологии является русский ученый Дмитрий Иосифович Ивановский, открывший в 1892 году вирус табачной мозаики (ВТМ) Вирусы настолько отличаются от микроорганизмов, что выделены в особое царство — царство Vira.

Особенности вирусов, отличающие их от всех других живых существ:

• 1) наличие только одного типа нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК, в то время как клетки всех остальных живых существ содержат ДНК и РНК, взаимодействие которых необходимо для биосинтеза белков;
• 2) отсутствие собственных белоксинтезирующих систем и клеточного строения;
• 3) внутриклеточный паразитизм на молекулярном (генетическом) уровне;
• 4) убиквитарность (распространенны повсеместно);
• 5) имеют микроскопические размеры.

Внеклеточная форма вируса — вирион и вирус, находящийся внутри клетки хозяина — это две разные формы вируса.

Вирионы разных вирусов имеют размеры от 15 до 400 нанометров. Нанометр — это 10−9 метра (рис. 6). Наиболее мелкие вирусы — вирусы полиомиелита — имеют вирион размером 17−25 им, средние — вирус гриппа — 80−120 нм, крупные — вирус оспы — 300−400 им.

В центре вириона располагается его геном. Это нуклеиновая кислота — ДНК или РНК (однонитевая или двунитевая). Плюс-однонитевая РНК несет две функции: наследственную и информационную, например у вируса полиомиелита. Минус-однонитевая РНК, как, например, у вируса гриппа, несет только наследственную функцию, и только в процессе репродукции вируса к ней достраивается плюс-нить иРНК.

Вокруг нуклеиновой кислоты симметрично располагаются белковые молекулы — капсомеры, составляющие капсид (лат. capsa — коробка). Различают спиральный тип симметрии, когда капсомеры уложены по всей длине молекулы нуклеиновой кислоты, и кубический, когда капсомеры располагаются в виде двадцатигранника (икосаэдра).

Вирионы, содержащие только нуклеиновую кислоту и белок, составляют нуклеокапсид. Это простые вирусы, например, ВТМ, вирус полиомиелита.

У вирионов сложноорганизованных вирусов имеется еще поверхностная оболочка — суперкапсид, содержащий, кроме белков, также углеводы, липиды, компоненты клетки хозяина. Строение вириона лежит в основе классификации вирусов. По типу нуклеиновой кислоты их делят на: рибовирусы и дезоксири-бовирусы, далее по структуре вирионов, по месту размножения и по другим признакам проводится деление на семейства и роды.

Вследствие малых размеров вирусы не видны в световом микроскопе. Только наиболее крупный из них — вирус оспы — можно наблюдать в виде мелких точечных образований — элементарных телец Пашена.

Размножаясь в чувствительных клетках организма, вирусы оспы, бешенства, гриппа образуют в них внутриклеточные включения. Их можно обнаружить в световом или в люминесцентном микроскопе. Обнаружение внутриклеточных включений используется для диагностики. Например, включения Бабеша-Негри в нервных клетках обнаруживаются при бешенстве.

Морфологию вирионов изучают в электронном микроскопе. Вирусы имеют разные формы: сферическую, нитевидную, палочковидную.

Методы культивирования вирусов:

• 1. Заражение животных (вбрюшинно, вв, вм, интраназально, заражение в мозг и другие)
• 2. На куриных эмбрионах после заражения их на хорион — аллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, в амниотическую полость, в желточный мешок.
• 3. На культуре клеток различных тканей.

Культура ткани — это клетки ткани, выращенные вне организма на специальной питательной среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняют присущий им обмен веществ и восприимчивость к определенным вирусам. Наиболее пригодными для культивирования вирусов являются клетки с быстрым росток и высоким обменом веществ. По этой причине широко применяют эмбриональные ткани (фибробласты куриных эмбрионов, клетки амниона человека и др.), а также культуры тканей опухолей. Выращивание клеток культур тканей производят в специальных флаконах (колбы — матрицы, флаконы Карреля и др.) и в пробирках. Культура клеток для роста должна иметь какую — либо опору, например, пластинки стекла, стенку пробирки. В выросшую культуру ткани, которая покрывает стенку сосуда или пластинку стекла в виде однослойного клеточного пласта, засевают материал, содержащий вирус. Работу производят в стерильных условиях. Для подавления роста другой микрофлоры (кроме вирусов) вируссодержащий материал предварительно обрабатывают антибиотиками, чаще пенициллином и стрептомицином. Размножение вируса в клетках определяют по цитопатическому действию (ЦПД): в результате размножения вируса в клетках при микроскопии обнаруживаются включения, дегенеративные изменения и в конечном итоге клетки гибнут. Так как рост клеток прекращается, ph среды мало изменяется по сравнению с контролем (клетки без вируса). В связи с этим не изменяется и цвет среды. Питательной средой для культуры тканей могут быть различные растворы, состав которых приближается к составу жидкостей организма (синтетическая среда 199, солевой раствор Хенкса с сывороткой, гидролизат лактальбумина с сывороткой и другие). В настоящее время в вирусологической практике чаще всего применят свежие культуры клеток (первичные или первично — трипсинизированные) и перевиваемые культуры (линии) клеток.

Первично — трипсинизированные культуры клеток готовят из органов взрослых животных (чаще из почек обезьян и других животных) и эмбрионов человека, куриных фиброфластов путем трипсинизации кусочков тканей с последующим культивированием в питательной среде. С этой целью кусочки тканей измельчают ножницами (или другим способом), а затем промывают буферным раствором Хенкса для удаления крови и обрабатывают 0,25 — 0,3% раствором трипсина. Трипсин разрушает межклеточные мостики и освобождает клетки. С помощью камеры Горяева подсчитывают количество клеток, разводят до концентрации 400 тыс. клеток в 1 мл. Полученную взвесь клеток разливают в пробирки, плотно закрывают стерильными резиновыми пробками и помещают в термостат при 37 °C в почти горизонтальном положении (под углом 50°) в специальных штативах. Через 3−4 дня на стенке пробирки образуется сплошной слой размножившихся клеток. Пробирки с хорошим ростом ткани отбирают для заражения вирусом.

Перевиваемые культуры клеток (растущие) — это стабильные линии клеток, пассируемые вне организма в течение многих лет. Их получают из злокачественных опухолей и из нормальных (эмбриональных) тканей человека и животных. К ним относятся: 1) линия Hela — клетки карциномы шейки матки человека; 2) линия Hep — 2 — клетки злокачественной опухоли гортани человека; 3) линия Детройт — 6 — клетки, выделенные из костного мозга человека, больного раком легких; 4) линии, А — 0 и, А — 1 — клетки амниона человека; 5) линия СОЦ — клетки сердца обезьяны циномольгус и другие.

Полуперевиваемые или диплоидные культуры клеток — это клетки тканей человека, сохраняющие в процессе пассажей — диплоидный набор хромосом. Диплоидные клетки человека не подвергаются злокачественному перерождению и этим выгодно отличаются от опухолевых.

Методы культивирования вирусов Вирусы — строгие внутриклеточные паразиты, поэтому их можно выращивать только в живых клетках. Для культивирования вирусов используют лабораторных животных, развивающиеся куриные эмбрионы и культуры клеток.

Лабораторные животные: белые мыши (для вирусов гриппа, Коксаки), кролики (вирус бешенства). Индикацию, то есть обнаружение вируса, проводят на основании развития типичных признаков заболевания и изменений органов животного.

Куриные эмбрионы 5−19-дневной инкубации пригодны для культивирования большинства вирусов: Преимущества метода: стерильность и отсутствие скрытых вирусных инфекций, возможность получения вирусов в больших количествах, простота техники работы. В зависимости от цели и от вида вируса материал вносят на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, желточный мешок, амниотическую полость. Индикацию вирусов проводят по характеру колоний вируса на хорион-аллантоисной оболочке. В аллантоисной жидкости вирусы обнаруживают по реакции гемагглютинации. Эта реакция основана на способности вируса гриппа и некоторых других вирусов агглютинировать (склеивать) куриные эритроциты.

Культура клеток — это клетки из органа животного или человека, которые живут и размножаются вне организма в питательном растворе (в среде 199 или в среде Хенкса). Культивирование в культуре клеток — один из наиболее распространенных методов в вирусологии. Чаще всего применяются однослойные культуры клеток, прикрепленные к стенкам пробирок или плоских флаконов. Различают несколько типов культур.

• 1) первично-трипсинизированные, которые получают, обрабатывая трипсином исходную ткань, например, почки обезьян, или эмбриональную ткань человека. Культура клеток используется однократно.
• 2) перевиваемые культуры клеток способны размножаться при многократных посевах на свежие питательные среды. Они могут поддерживаться в лаборатории путем постоянных пересевов в течение десятков лет. Во многих лабораториях применяются перевиваемые культуры, полученные из раковой ткани человека: HeLa, ИЕр-2 и др.
• 3) полуперевиваемые культуры клеток — это, например, диплоидные клетки из фибробластов человеческого эмбриона, способные размножаться в течение 40−50 пассажей (пересевов), сохраняя исходный диплоидный набор хромосом.

Обнаружение вирусов в культуре клеток. Вирусы в культуре клеток обнаруживаются по цитопатическому действию (ЦПД), которое вызывают многие вирусы, например, вирус полиомиелита. ЦПД проявляется в дегенерации и разрушении клеток, или в формировании многоядерных клеток.

ЦПД можно обнаружить по цветной пробе. Для этого используют клетки, помещенные в питательную среду с индикатором, например, метиловым красным. При размножении незараженных клеток образуются кислые продукты метаболизма, и индикатор меняет цвет на желтый. Если клетки заражены вирусом, происходит нарушение нормального метаболизма клеток, и цвет среды не меняется.

Репродукцию вируса в клетке можно обнаружить и по образованию внутриклеточных включений.

Для подсчета количества вирионов используют метод бляшек. Клеточный монослой, покрытый тонким слоем агара, в плоском флаконе, заражают вирусом и по количеству бляшек или «стерильных пятен» подсчитывают количество вирионов. Считается, что одна бляшка образуется при размножении одного вириона.

Репродукцию вируса в клетке можно обнаружить также по реакции гемадсорбции. Это вариант реакции гемагглютинации. Эритроциты, внесенные в культуру клеток, адсорбируются на поверхности клеток, зараженных вирусом. Реакцию применяют, например, для обнаружения вируса гриппа.