Лабораторная работа № 7. Получение каллусной ткани из листьев табака

Для растения in vivo каллус — это группа клеток, возникающая при травмах и защищающая место поранения (раневая паренхима). В ней накапливаются питательные вещества для регенерации анатомических структур или утраченного органа. На питательных средах с большим содержанием ауксинов (2,4-Д) клетки экспланта дедифференцируются. Клетки утрачивают прежние функции и морфологию. Особенности дедифференциации клеток экспланта зависят от генетики экспланта. Причем чем менее дифференцирована клетка, тем легче получить каллус. Дедифференциация специализированных клеток начинается с обогащения их элементами цитоплазмы: микротрубочками, мембранами ЭПС и комплекса Гольджи, рибосомами; исчезают хлорои хромопласты, продукты их деятельности; может образоваться много ядер или увеличиться число хромосом; укрупняются вакуоли. Каллус, выращиваемый поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной структуры. Клетки каллуса либо бесцветны, либо имеют желтоватый оттенок. В зависимости от происхождения и условий культивирования, различают каллусы: рыхлые, с сильно оводненными, легко отделяющимися друг от друга клетками; средней плотности, с зонами меристематической активности; плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов.

В биотехнологии чаще всего используют те виды растений, которые и в обычных условиях легко укореняются, регенерируют, образуют каллус. Клетки табака легко дедифференцируются и переходят к делению, образуя быстрорастущую каллусную ткань. Поэтому большинство методов получения и культивирования каллуса разработано для табака. Каллусы можно получить практически из любой части растения. Для культивирования каллусов из листьев табака используют среду Мурасиге — Скуга (МС) с добавлением ауксинов (2,4-Д).

Цель работы: освоить метод приготовления питательной среды для получения каллусной культуры табака.

Оборудование и материалы: чашки Петри со стерильной питательной средой МС для индукций каллусогенеза, 6%-й раствор хлорамина, колбы со стерильной дистиллированной водой.

Объект исследования: растения табака.

Таблица 1

Приготовление маточных растворов для среды Мурасиге — Скуга (МС).

Таблица 2

Среда Мурасиге — Скуга (МС) для клеточных и тканевых культур

Окончание табл. 2

Ход работы.

Приготовить питательные среды МС с добавлением: а) 1,0 мг/л 2,4-Д + + 0,2 мг/л БАП; б) 1,0 мг/л ИУК + 0,2 мг/л БАП. Листья табака поместить в дезинфицирующий раствор на 5 мин, затем промыть стерильной дистиллированной водой три раза.

Стерильным скальпелем вырезать сегменты у основания листа ближе к центральной жилке длиной 1,5—2 см, шириной 1 см. Для лучшего каллусообразования делают насечки по всей поверхности сегмента. Поместить экспланты на питательные среды (перед каждой манипуляцией инструменты обрабатывать спиртом и обжигать на пламени спиртовки). Чашки Петри с эксплантами перенести в термостат для индукций каллусогенеза при температуре 25 °C.

Задание. Результаты опыта рассмотреть через две — четыре недели, зарисовать, сравнить каллус, полученный на среде с ИУК, с каллусом, полученным в среде с 2,4-Д. Сделать выводы.