Кислотная инактивация б-амилаз

В изучении кислотной инактивации б-амилаз заслуживает особого внимания получение их в кристаллическом или высокоочищенном состоянии. Сопоставление кинетики инактивации растворов высокоочищенных ферментов с растворами неочищенных ферментов позволяет глубже представить механизм этого процесса.

Очистка и кристаллизация ферментов — весьма трудная задача. Теория кристаллизации белков с их сложной трехмерной структурой, дающая хотя бы общие представления о закономерности этих процессов, отсутствует.

При очистке и кристаллизации данного фермента обязательным является наличие в среде ионов кальция, достаточно высокое значение рН (5,5 — 7,5), низкая температура. Последнее приобретает особо важное значение при использовании органических растворителей. Несоблюдение указанных условий приводит к полной потере ферментативной активности.

Установлено, что инактивация ферментов под действием Н⁺-ионов представляет собой результат предварительно ионизированных процессов, глубоко затрагивающих электростатические взаимодействия в белковой молекуле ферментов [7]. Однако, несмотря на сложность процесса перехода нативного фермента в инактивированное состояние, в конечном счете в каждом элементарном акте инактивации принимает участие только молекула фермента и именно в ней происходят изменения специфической конформации, ведущие к разрушению каталитического центра.

Исходя из представлений о мономолекулярности процесса инактивации ферментов, нельзя однако без должной проверки рассматривать эту реакцию как реакцию первого порядка. Лейдлер рассматривает порядок реакции как строго экспериментальную величину, показывающую характер зависимости скорости реакции от концентрации реагирующих веществ, тогда как молекулярность реакции обозначает число молекул, вступающих в элементарную реакцию. Тем не менее, инактивация многих ферментов, в том числе и под действием Н-ионов, является реакцией первого порядка [7]. Величины К (константа скорости перехода активной формы в инактивированную) амилаз микроскопических грибов при соответствующих рН близки между собой. Солодовая б-амилаза более чувствительна к действию Н⁺ — ионов: если резкая инактивация амилаз микроскопических грибов наступает при рН 4,5, то для солодовой б-амилазы она отмечается уже при рН 5,5. Величина К солодовой амилазы в 10−30 раз выше таковой амилаз микроскопических грибов. По стабильности к б-амилазе солода близка амилаза слюны человека; что же касается амилаз Asp. usamii и Asp. batatae, то для них отмечена более высокая устойчивость к ионам водорода. Скорость кислотной инактивации б-амилаз находится в тесной взаимосвязи не только с концентрацией Н⁺ — ионов в среде, но и с наличием в ней Са²⁺ ионов.

Для сред, содержащих кальций, характерны две особенности инактивации: во-первых, чем выше концентрация Са²⁺-ионов при одном и том же рН, тем меньше К; во-вторых, чем ниже рН, тем больше необходимо Са²⁺-ионов, чтобы предотвратить кислотную инактивацию фермента. Иными словами, кислотная инактивация б-амилаз в средах, содержащих Са²⁺-ионы, подчиняется закону.

Необходимо отметить, что стабилизирующее действие ионов Са²⁺ на б-Амилазу имеет место лишь при низких концентрациях его в среде. При высоких концентрациях эффект стабилизации уменьшается. Стабилизирующее действие Са²⁺-ионов при кислотной инактивации б-Амилаз и, наоборот, инактивация в присутствии веществ, специфически связывающих кальций, свидетельствуют о том, что в основе инактивации фермента, как Н⁺-ионами, так и аддендами, лежит один и тот же механизм.

Инактивирующее действие аддендов позволяет отнести б-амилазы к группе истинных металлоферментов [2]. Доказательством того, что б-амилазы относятся к числу истинных металлоферментов, является также существенное различие в скорости их биосинтеза при наличии или отсутствии в среде кальция. Хамада, Ямамото Фукумото, выращивая микробные клетки Вас. subtilis, нашли, что кальций в значительной степени способствует увеличению образования б-амилазы. Наконец, об б-амилазах как истинных металлоферментах говорит факт строгой стехиометричности соотношений атомов кальция и белка этих ферментов.

Оикава и Маеда установили, что во время диализа раствора кристаллической б-амилазы Asp. oryzae против 0,02 М раствора ацетата натрия молярное отношение кальция к амилазе быстро понижалось от 10 до 1, в то время как ферментативная активность не снижалась, а даже наблюдалось незначительное ее увеличение. Неизменным оставалось оптическое вращение. Дальнейший диализ не приводил к изменению этих показателей. Внесение ЭДТА· Na₂ в раствор фермен-та вызвало снижение содержания кальция, уменьшение ферментативной активности и быстрое увеличение левого вращения. По окончании диализа б-амилаза содержала 0,21 г-атом кальция на 1 г-моль фермента, а активность составляла 30% от максимальной величины. Была отмечена необратимая инактивация фермента. Это позволило сделать вывод, что она имела не прямой, а косвенный характер, как результат удаления кальция. То же самое отмечено для кислотоустойчивой б-амилазы Asp. niger, Asp. awamori [7].

Хью, Фишер, Штейн пришли к выводу, что на 1 моль б-амилазы Asp. oryzae и б-Амилазы слюны человека приходится 1 атом кальция, на 1 моль б-амилазы Вас. subtilis — 4 атома кальция. Удаление указанных атомов сопровождается потерей ферментативной активности. Инактивация б-амилазы Asp. oryzae становится необратимой. Внесением кальция в раствор б-амилазы слюны человека и б-амилазы Вас. subtilis удалось количественно восстановить активность этих ферментов. Интереснее всего то, что, подобрав мягкие условия электродиализа, Штейн, Хью, Фишер получили кристаллическую активную б-амилазу слюны человека, свободную от кальция. [8].

Используя электродиализ, Иманичи получил бактериальную б-амилазу, свободную от кальция. Однако фермент был весьма чувствителен к воздействию температуры и мочевины. Чтобы полностью восстановить фермент в нативное состояние, необходимо присутствие в среде, по крайней мере, 4—5 атомов кальция на 1 моль фермента.

Заслуживает особого интереса тот факт, что удаление кальция происходит с двумя различными скоростями: в первый период снижение содержания кальция до 1 г-атома на 1 г-моль фермента идет быстро, во второй — удаление последнего г-атома идет весьма медленно.

Следовательно, последний атом кальция наиболее прочно связан в белке фермента. Однако эта прочность для амилаз различного происхождения весьма различна и уменьшается в такой последовательности: б-амилаза Asp. oryzae > б-амилаза Вас. subtilis > б-амилаза слюны человека, б-амилаза свиной поджелудочной железы > б-амилаза ячменного солода.

Удаление последнего атома кальция ведет к глубоким конформационным изменениям в ферменте, близким или идентичным по своему характеру к денатурации белков. Убедительным подтверждением этому является увеличение левого оптического вращения, появление ранее замаскированных SH-групп, возрастание вязкости, изменение полярографической волны [8].

Согласно упомянутым исследованиям роль кальция в молекуле фермента заключается в создании между белком и металлом уплотненной структуры. Металл «сшивает» функциональные группы, расположенные на отдельных участках полипептидной цепи молекулы фермента, и образует внутримолекулярную поперечную связь, которая, очевидно, принимает участие в формировании третичной структуры фермента и, следовательно, его каталитического центра. Эта связь придает в целом молекуле фермента достаточно высокую прочность. Штейн, Хью, Фишер считают, что кальций можно представить как «замочный шип» в цельной молекулярной структуре фермента. Следовательно, кальций Са²⁺ апофермент б-Амилазы можно представить как типичный клешневидный комплекс.

Как было отмечено выше, внесение Са²⁺-ионов в раствор не влияет на активность б-амилазы. Более того, удаление ионов данного металла, не связанных с белком фермента, вызывает некоторое увеличение его активности. Следовательно, Са²⁺-ион оказывает только стабилизирующее влияние на конформацию молекулы фермента и его активный центр. Этот ион не является непосредственным компонентом активного центра амилаз и вряд ли имеет какое-либо значение в образовании фермент-субстратного комплекса.

Кальций играет роль фактора, предохраняющего б-амилазы от расщепления протеолитическими ферментами. Кристаллическая б-амилаза слюны человека, свиной поджелудочной железы, Вас. subtilis, Asp. oryzae сохраняют в полной мере активность при инкубации с большими количествами трипсина, химотрипсина, субтилизина, пепсина, папаина. Напротив, при одновременном действии протеаз и реагентов, специфически связывающих кальций, амилазы легко инактивируются и расщепляются. Данный факт свидетельствует о том, что стабилизирующее действие кальция не ограничивается активным центром, а распространяется на всю конформацию белковой молекулы фермента. Удаление кальция обусловливает создание рыхлой структуры фермента, доступной протеолизу.