Модифицированный метод подсчета количества веществ низкой и средней молекулярной массы биологических субстратов

МОДИФИЦИРОВАННЫЙ МЕТОД ПОДСЧЕТА КОЛИЧЕСТВА ВЕЩЕСТВ НИЗКОЙ И СРЕДНЕЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ СУБСТРАТОВ

В настоящее время широкое распространение в лабораторной диагностике получил метод определения веществ средней и низкой молекулярной массы (ВНСММ) [1]. Он позволяет регистрировать значительное количество ВНСММ в биологических субстратах, которое может служить мерой оценки метаболического статуса организма и одним из критериев степени интоксикации [2]. При этом количество ВНСММ определяется на основании спектра поглощения образца в диапазоне от 238 нм до 298 нм.

Традиционно используемый метод расчета показателя ВНСММ крови М. Я. Малаховой [1] является довольно трудоемким в плане числа измерений, необходимых для построения спектральной кривой и последующего расчета площади под ней. Нами было установлено, что зависимость оптической плотности образцов от длины волны в диапазоне 238 — 298 нм описывается полиномами. Поэтому вполне допустимо снимать значения экстинкций с шагом большим, чем 4 нм с последующим нахождением промежуточных точек путем интерполирования. Использование такого методического подхода возможно если не ставиться цель идентификации веществ, соответствующих пропущенным длинам волн. Точность такой оценки будет определяться числом опорных точек, то есть величин экстинкций, полученных экспериментально. Мы предлагаем шаг измерения увеличить до 12 нм, сократив, таким образом, число опорных точек на выбранном интервале с 16 до 6 (рис.1). Для определение пропущенных значений и, если требуется, построение графика кривой производится интерполирование [3].

лабораторная диагностика молекулярная масса.

Искомая кривая будет описываться уравнением:

(1).

где л — длина волны, a₀, a₁, …, a₅ — коэффициенты полинома.

Площадь (S) под кривой находится с помощью интегрирования (1) в пределах 238 — 298 нм:

(2).

где b — эмпирический поправочный коэффициент, который составляет 0,994.

Оценка точности вычисления площадей проводилась путем сравнения полученных с помощью (2) значений с величинами, найденными путем прямого подсчета по всем 16 точкам для тех же кривых. С использованием непараметрического критерия Вальда-Вольфовица было показано отсутствие статистически достоверных различий между этими двумя выборками (p = 1; n = 59). Соответствующие средние значения приведены в таблице 1.

Табл.1

Средние значения площадей под спектральными кривыми для веществ низкой и средней молекулярной массы плазмы и эритроцитов, вычисленные разными способами, n = 59, (M±m).

После соответствующего упрощения, учета поправочного коэффициента и округления коэффициентов до трех знаков после запятой формула для вычисления площади под кривой для плазмы крови будет иметь вид:

где E_n — величина светопоглощения на длине волны n нм, 0,994 — эмпирический поправочный коэффициент.

Для эритроцитов производят измерения начиная не с 238, а с 242 нм. Это связано с тем, что оптическая плотность проб этого субстрата при 238 нм сильно возрастает и превышает единицу, что неблагоприятно сказывается на точности измерений (рис.2).

Cпектральная кривая для эритроцитов в диапазоне 246−294 нм описываем полиномом четвертой степени с последующим его интегрированием, а площади в диапазонах 242−246 нм и 294−298 нм считаем по формуле трапеций.

Итоговая формула для эритроцитов, полученная нами, имеет вид:

Рис. 2 Экспериментально полученная и воссозданная спектральная кривая веществ низкой и средней молекулярной массы эритроцитов

(4).

Оценка точности вычисления площадей путем сравнения полученных с помощью (3) и (4) значений с величинами, найденными путем прямого подсчета по всем 16 точкам для тех же кривых с использованием непараметрического критерия Вальда-Вольфовица показала отсутствие статистически достоверных различий между этими двумя выборками (p = 1; n = 59).

Таким образом, предлагаемый метод позволяет без снижения точности проводимых исследований снизить трудоемкость и время исследований, за счет сокращения числа экспериментально получаемых точек. Это важно при исследовании большого количества образцов, поскольку пул изучаемых веществ изменяет свои качественные и количественные характеристики через несколько часов после забора образцов.