Подготовка белкового образца

Наиболее простой путь избавления от небелковых компонентов, мешающих определению белка, — это осаждение белка. В этом случае потребуется строить два калибровочных графика: первый — на основании разведений стандарта, осажденного таким же образом, что и опытная проба, а второй — используя те же разведения стандарта, но без осаждения, чтобы определить, сколько белка было потеряно в ходе осаждения.

Осаждение ацетоном является самым простым и совместимым с описанными выше методами определения белка. К раствору белка добавляют холодный (-20°С) 100% ацетон до конечной концентрации 80%. После инкубации не менее 1 ч при — 20 °C белок осаждают центрифугированием (20 мин, 15 000 g, 4°С). Как правило, этих условий достаточно для осаждения белка, но если содержание белка в исходном растворе низкое, то могут потребоваться более высокие скорости центрифугирования. Затем следует осторожно отобрать надосадочную жидкость. После этого необходимо высушить осадок при комнатной температуре или при — 20 °C. Очень важно не пересушить осадок белка, в противном случае могут появиться сложности с растворением осадка в буфере/растворе, совместимом с выбранным методом определения белка. Хотя способ осаждения белка ацетоном прост, могут потребоваться большие объемы ацетона, вследствие чего нужно проводить несколько повторных центрифугирований, что удлиняет процедуру. В этом случае можно осаждать белок трихлоруксусной кислотой (ТХУ).

При осаждении белка ТХУ нужно знать, кислота какой концентрации необходима для осаждения белков, присутствующих в исследуемом образце. Другой очень важный момент, возникающий при использовании ТХУ, — убрать избыток кислоты перед растворением белкового осадка. К белковой пробе добавляют ТХУ до выбранной конечной концентрации, тщательно перемешивают и инкубируют не менее 30 мин во льду. Затем белок осаждают центрифугированием, как описано выше. После удаления надосадочной жидкости осадок белка промывают холодным (-20°С) 80% ацетоном. Для удаления ТХУ потребуется, по крайней мере, 3−4 отмывки. Отмытый от ТХУ осадок белка высушивают при комнатной температуре или при — 20 °C, не пересушивая. Затем растворяют осадок в буфере/растворе, совместимом с выбранным методом определения белка.

Кроме ацетона и ТХУ, белок можно осадить смесью хлороформа с метанолом, которые берут в разных соотношениях в зависимости от природы белков, находящихся в исследуемом препарате. При этом образуются две фазы, разделенные белком. После тщательного удаления фаз осадок белка промывают метанолом, затем высушивают и растворяют в выбранном буфере.

Чтобы снизить концентрацию веществ, мешающих использованию выбранного метода определения белка, белковый препарат можно разбавить, но этот прием подходит только для образцов с высокой концентрацией белка.

Также можно избавиться или существенно снизить концентрацию несовместимых веществ путем перевода белков в другой буфер при помощи гель-фильтрация в миниколонках, например, PD-10 или NAC-5 и NAC-10 (GE Health Care) в соответствии с прилагаемыми инструкциям. Гель-фильтрация приведет к разбавлению белкового раствора, который можно концентрировать при помощи специальных концентрирующих фильтров.

Сейчас для определения содержания белка используют коммерческие наборы реактивов. Фирмы «Sigma», «Bio-Rad», «Pierce» и многие другие продают киты, которые давно и успешно применяются. Для тех читателей, которые хотят самостоятельно готовить реагенты, используемые в описанных выше методах, в Приложении приведем их «рецепты», а также соответствующие протоколы (микроформат) для каждого из рассмотренных выше методов определения содержания белка.

Авторы выражают благодарность Российскому фонду фундаментальных исследований за финансовую поддержку (гранты №№ 11−04−1 006 и 11−04−1 509).