Материалы и методы

Реагенты

Моноклональные антитела: анти-HSP70 (клон BRM-22, Sigma-Aldrich, CША), анти-Hsp70 (клон С92F3A-5, Enzo Life Sciences, США), анти-Hsc70 (клон 1B5, Enzo Life Sciences, США), анти-в-актин (клон AC-15, SigmaAldrich, США); CD63-FITC (BioLegend, США); CD66b-FITC (BioLegend, США); CD107a-PE-Cy5 (клон eBioH4A3, eBioscience, США); CD14-PE (Сорбент, РФ).

Поликлональные антитела: анти-NOX2/gp91phox (Abcam, США); антиHsp70/Hsc70 (Santa-Cruz Biotechnology, США); анти-Fab-фрагмент IgG мыши (Sigma-Aldrich, США) или крысы (eBioscience, США), PE-конъюгированные; анти-Ig мыши, коньюгированные с пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich, США), анти-Ig кролика, AF488-конъюгированные (Life Technologies, США) (где FITC — флуоресцеинизотиоцианат, PE — фикоэритрин, PE-Cy5 -цианофикоэритрин, AF488 — Alexa Fluor 488 нм.

Реагенты для выделения нейтрофилов из периферической крови человека и подготовки образцов: градиентная среда для выделения Polymorphprep (Axis-Shield, Швеция); фосфатно-солевой буфер DPBS, pH 7.2−7.4; бесцветный раствор Хэнкса; синтетическая среда RPMI-1640 (все ПанЭко, РФ); эмбриональная телячья сыворотка HyClone (Thermo Scientific, США); L-глутамин (ПанЭко, РФ); HEPES; циклогексимид, глибенкламид (все Sigma-Aldrich, США); хлорид аммония (Химмед, РФ).

Реагенты для оценки жизнеспособности, фиксации и пермеабилизации нейтрофилов: трипановый синий (ПанЭко, РФ); пропидия йодид (PI) (SigmaAldrich, США). Параформальдегид (Riedel-de Haen, Германия); тритон X-100 (Хеликон, РФ); бычий сывороточный альбумин (BSA) (ПанЭко, РФ); набор для внутриклеточного окрашивания Cytofix/Cytoperm (Beckton Dickinson, США).

Реагенты для лизирования нейтрофилов и Вестерн-блоттинга: смесь ингибиторов протеаз (Thermo Scientific, США); реагент Брэдфорда (BioRad,.

США); нитроцеллюлозная мембрана (Sigma-Aldrich, США); Tween 20 (Хеликон, РФ); обезжиренное сухое молоко (Roth, Германия); диаминобензидин (Sigma-Aldrich, США); акриламид, бис-акриламид (ПанЭко, РФ); натрия додецилсульфат (SDS) (Panreac, США); персульфат аммония (PSA) (Sigma-Aldrich, США); преокрашенный маркер малекулярных масс (Bio-Rad, США); неорганические соли (Пан-Эко, РФ).

Реагенты для определения АФК: 2'-7'-дихлорфлуоресцеин диацетат (DCFH-DA) (Invitrogen, США); люминол (Serva, Германия); зимозан A; формил-метил-лейцил-фенилаланильный пептид (fMLP) (все Sigma Aldrich, США).

Реагенты для выделения тотальной РНК, обратной транскрипции, полимеразной цепной реакции (PCR) и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (qRT-PCR): TRIzol реагент (MRC, Великобритания); РНК-аза, А (Sigma-Aldrich, США); ДНКаза I (Thermo Scientific, США); обратная транскриптаза MINT; реакционная смесь для RTPCR qPCRmix-HS SYBR (все Евроген, РФ); набор для проведения PCR GenPak PCR MasterMix Core (Isogene Lab., РФ).