Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК

Секвенирование позволяет довольно быстро определить полную нуклеотидную последовательность ДНК длиной 100−500 нуклеотидных пар. Это необходимо для выяснения структуры, функций, возможностей рекомбинации и амплификации молекул или фрагментов молекул нуклеиновых кислот.

С помощью ферментов ДНК разделяют на фрагменты и определяют в них позиции нуклеотидов химическим или энзиматическим методом.

Химический метод был предложен в 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом (рис. 4.4). Он основан на химической дег;

Рис. 4.4. Схема химического метода определения нуклеотидных последовательностей (по А. С. Коничеву и Г. А. Севастьяновой, 2003): 1−10 длина (число нуклеотидов) фракционируемых методом электрофореза радиоактивно меченных фрагментов радации ДНК — специфической химической модификации пуриновых и пиримидиновых оснований с последующими выщеплением модифицированных нуклеотидов из цепи ДНК и анализом образовавшихся продуктов методом гель-электрофореза. Перед началом опыта один из концов фрагмента ДНК метят с помощью изотопа фосфора ³²Р. Полученные электрофореграммы проявляют с помощью рентгеновской пленки. Таким образом, фракционируя на одной гелевой пластине фрагменты, образовавшиеся после специфического вьпцепления каждого из четырех нуклеотидов (А, Т, Г и Ц), можно непосредственно читать нуклеотидную последовательность секвенируемой ДНК по проявленной электрофореграмме.

Энзиматический метод, разработанный М. Сэнгером, основан не на химическом, а на ферментативном подходе. Сэнгер использовал ДНК-полимеразу I (рис. 4.5). Анализируемый фрагмент ДНК используют в качестве матрицы в реакции полимеразного копирования (синтеза комплементарной цепи ДНК) с помощью ДНК-полимеразы I Е. coli. Метод получил название «плюс-минус-метод», поскольку реакцию полимеризации в нем изначально проводили либо в отсутствие одного из четырех типов нуклеотидов («минус"-система), либо в присутствии только одного нуклеотида («плюс"-система), что ограничивает возможность наращивания полинуклеотидной цепи, т. е. останавливает (терминирует) ее синтез из-за недостатка соответствующего нуклеотида. Затем для остановки синтеза стали использовать специальные молекулы — терминаторы. Продукты реакций анализируют методом электрофореза, и секвенируемую последовательность считывают с радиоавтографа, так же как при анализе химического секвенирования.

В настоящее время определение точной нуклеотидной последовательности любого фрагмента ДНК вполне разрешимая задача. Уже определены последовательности не только сотен генов прои эукариот, но и геномы многих организмов (более 800). Зная последовательность гена и генетический код, легко определить аминокислотную последовательность кодируемого им белка.

Рис. 4.5. Схема энзиматического метода определения нуклеотидных последовательностей (по А. С. Коничеву и Г. А. Севастьяновой, 2003). Представлена последовательность операций секвенирования и схема радиоавтографа гелевой пластины после разделения фрагментов. Для синтеза фрагментов был использован (Х[³² Р]-дезоксиЫТР. Приведена структура ddATP.