Методы лабораторной диагностики

Для обнаружения возбудителя в исследуемых образцах используют РИФ, ПЦР. Выделения вируса проводят на культуре лейкоцитов свиней и клетках костного мозга свиней. Идентификацию выделенного возбудителя осуществляют с помощью реакции гемадсорбции и метода флуоресцирующих антител. Параллельно ставят биопробу на вакцинированных и не вакцинированных против КЧС поросятах. Для серологических исследований применяют РСК, РДП в реальном времени.

Экспресс-методы: РИФ, ПЦР

РИФ: 1. Готовим мазки-отпечатки из легких, селезенки, лимфатических узлов;

• 2. Высушиваем на воздухе, фиксируем ацетоном при комнатной температуре 10 мин, высушиваем при 37С в течении 20 мин;
• 3. Наносим меченные антитела и оставляем на 30 мин при температуре 37С во влажной камере;
• 4. Отмываем фосфатным буфером (рН 7);
• 5. микроскопируем в люминисцентный микроскоп;
• 6. учет: наблюдаем специфическое свечение зеленого цвета.

Параллельно реакцию проводим на препаратах, приготовленных из органов, заведомо здоровых животных (контроль). В нашем случае реакцию можно считать положительной, так как специфическое свечение наблюдается в виде отдельных гранул и скоплений, а так же реакцию расцениваем положительной на основании отсутствия флюоресцирующих включений в контрольных препаратах; при отсутствии светящихся включений в инфицированных препаратах путем предварительной обработки их немеченой антисывороткой к вирусу АЧС.

Для данного метода необходимо использование специального оборудования для детекции флюоресцентного сигнала. ПЦР — тест-система позволяет достичь высокого уровня чувствительности с помощью 2-х праймеров, используемых в стандартный ПЦР. Это позволяет в течение 5-и часов обнаружить 10 частиц в 1 мл инфекционного вируса в различных материалах, включая пробы органов свиней с хроническими и латентными формами течения болезни.

• 1. Проводим многократное повторение циклов денатурации исследуемой ДНК при 94С;
• 2. Проводим гибридизацию ДНК со специфическими праймерами Kingb-s последовательность 5'JCTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA J3', Kingb-a последовательность 5'JGATACCACAAGATCRGCCGT J3' при температуре 55 С и синтеза в них комплементарных цепей ДНК с помощью ДНК-полимеразы прит температуре 72С;
• 3. В амплификаторе проводим синтез в этом участке — стадии амплификации проводим 30−40 раз за 1,5 — 3 часа;
• 4. Учет реакции проводим с помощью электрофореза в агарозном геле.