Носители иммобилизованных систем твердофазного иммуноанализа

Развитие и использование твёрдофазных методов анализа предъявляет высокие требования к качеству иммуносорбентов. Согласно гипотезе В. Б. Алесковского (1976), любое твердое тело имеет остов и облегающие его атомы и группы атомов. С химической точки зрения, остовненасыщенное высокомолекулярное образование, представляющее собой макрорадикал, вокруг которого расположены функциональные группы высокомолекулярного соединения. Именно наличие этих групп определяет возможность использования поверхностных реакций для синтеза новых твердых веществ. Иммобилизация на твёрдых носителях различных биомолекул приводит к значительному повышению их термической устойчивости и стабильности (Абелян В. А., Африкян Э. Г., 1992; Масько А. А. c шавт., 1992).

В качестве сорбентов широко используются агарозные матрицы, активированные BrCN (Lowe C.R., Dean D.G., 1974.). Однако, наряду со всеми положительными сторонами данной матрицы, следует отметить недостаточную стабильность связи между лигандом и BrCNактивированной агарозой (Turkova J., 1978), низкую механическую стабильность сорбентов, что ограничивает возможности их практического использования.

В качестве природных твёрдофазных носителей используют целлюлозу, крахмал, агарозу (Аленкина Т.В., Данилина И. В., 2002) и т. д. Известны исследования по использованию в качестве матрицы сорбентов полисахарида.

— хитина (Бендекене В.Г. с соавт., 1981); биосорбентов, состоящих из фрак-ции молочных белков — казеина, который обладает термостабильностью, способностью связывать воду, коагулировать, желировать; микрокристаллической целлюлозы, являющейся неионогенным, гидрофильным полисахаридом (Кунижев С.М. c шавт., 2002); полиакриламидного геля, обладающего химической стабильностью и инертностью, прозрачностью, лабильностью структуры, устойчивостью к изменениям рН и температуры, нерастворимостью в большинстве растворителей (Гавенский С. Д. с соавт., 1990, 1991; Гавенский С. Д., Пушкарь В. Г., 1995; Подзолкова Г. Г. с соавт., 1988). Но данные препараты имеют недостатки, связанные с длительностью, многостадийностью их получения и использованием дорогостоящих импортных реактивов (Тюменцева И.С., 1996). В настоящее время широко применяются сорбенты на основе кремнезёма (Киселёв А.В., Кустова Т. Л., 1976; Хохлова Т. Д., Гаркавенко Л. Г., Никитин Ю. С., 1991; Брыкалов А. В., 1991; Темишевская Л. Я., 1995; Taylor D., 1972; Marshall K., Ridgewee N., Simpson J., 1974; Snyder L.R., Kirkland J.J., 1979). Это связано с тем, что их матрица по своей геометрической структуре и химическим свойствам хорошо подходит для адсорбции биополимеров.

В настоящее время созданы различные иммобилизованные структуры: биоаффинные адсорбенты (Гайда А.В., Староверов С. М., 1989; Лисичкин Г. В., 1989; Гонтарь И. П. с соавт., 1996); иммобилизованные ферменты (Брыкалов А.В. с соавт, 1982; Брыкалов А. В., 1993; Коваленко Г. А. с соавт., 2002); иммобилизованные лекарственные средства (Брыкалов А.В., Кобанкова А. Н., 2002; Герстунбергер М. Р. с соавт, 2002; Кунижев С. М., Аполохова С. Ф., 2002). В практической деятельности человека находят применение иммоби-лизованные клетки и антитела (Кузовлева А.А., Шаханина К. Л., 1982; Гавенский С. Д. с соавт., 1991; Ефременко В. И., 1997; Лавриненко И. А., Костров-ский В.Г., 1997; Кислицын Ю. В., Мешандин А. Г., 2001; Lea T. et al., 1985; Cunliffe D. et al., 2000). При постановке иммуноанализов (Kriz K., Gerhrke J.,.

Kriz D., 1998; Yu H., 1998; Tanaka T., Matsunaga T., 2001; Richardson J. et al., 2001); культивировании микроорганизмов (Владимцева И.В., 2002; Hornung M., Ludwic M, Schmauder H.P., 2002) в ряде случаев также применяют различные иммобилизованные системы.

В качестве твёрдофазных носителей широкое распространение получили кремнезёмы. Реакционную способность их можно существенно повысить, обрабатывая поверхность различными неорганическими и металлоорганиче-скими соединениями (Рогожина С.В., Варламов В. П., Вальковский Д. Г., 1975; Алесковский В. В., Юффа А. Я., 1989; Ходж Ф., 1989; Ходж Ф., 1989; Березин В. Б., Лахтин В. М., Ямсков И. А., 1995; Chim C., Wold F., 1974; Weetall H.H., Detor C.C., 1975), путём молекулярного наслаивания (Алесковский В.В., Юффа А. Я., 1989), либо подвергая механическому воздействию (растирание, дробление в среде модификатора) или облучению (у и УФ). Метод химического модифицирования кремнезёмов с целью получения функциональных органокремнезёмов хорошо изучен и позволяет получать сорбенты с требуемыми свойствами. Им присущи гидрофильность, жесткость остова, химическая (Постнова А.М., Пак В. Н., Кольцов С. И., 1981) и микро-биологическая устойчивость, каталитическая активность (Кольцов С.И., Але-сковский В. Б., 1973), ненабухаемость в растворах, значительная адсорбционная емкость, отсутствие токсичности. Поверхность кремнеземных сорбентов содержит большое число силанольных (SiOH) и силоксановых групп (Si-O-Si) (Черкасов А.Н., Пасечник В. А., 1991).

Носители, обладающие магнитными свойствами и предназначенные для фиксации на них биополимеров, имеют значительные преимущества по сравнению с немагнитными. При их использовании не требуется предварительного концентрирования исследуемых проб с отделением выявляемых микроорганизмов от контаминирующей микрофлоры и других примесей, возможность проведения индикации на качественно более высоком уровне. В результате использования магносорбентов, способных осуществлять на себе селективное концентрирование микроорганизмов, появляется возможность исследования проб с высокой степенью загрязненности, неограниченных объемов, с низкой концентрацией микроорганизмов при высокой чувствительности и специфичности метода исследования (Ефременко В.И., 1997; Weimer B.C. et al., 2001).

В качестве магнитных материалов в МС обычно используются окислы металлов Fe, Ni, Co (Пушкарь В.Г. с соавт., 1984), порошки этих окислов заключаются в микросферы, плёнки полимеров, гранулы. А. М. Тишин, Ю. И. Спичкин (2004) предлагают использовать магнитный сорбент, состоящий из гидрофобного полимерного связывающего компонента, состоящего из моче-вино-формальдегидной смеси с порофором и отвердителем, алюмосиликат-ного магнитного наполнителя и минерального масла. Г. Д. Елистратов, М. И. Волчанова, И. В. Малыгин с соавт. (2004) предлагают способ получения сорбента из измельчённого углеродсодержащего сырья, представляющего собой древесные частицы или отходы переработки однолетних растений.

Специалисты Литовского института химии и химической технологии установили возможность иммобилизации трипсина на магнитном хитине. Сравнительное изучение свойств нативного и магнитного производных хитина показало, что «намагничивание» матрицы способствовало уменьшению набухаемости, сохранению адсорбционных свойств и упрощению процесса выделения и регенерации иммобилизованных препаратов трипсина в результате применения внешнего магнитного поля (Бендикене В. Г. с соавт., 1995).

В связи с этим, МИС находят все большее применение в диагностике и обнаружении возбудителей различных заболеваний (Тюменцева И.С., Ефременко В. И., Афанасьев Е. Н. с соавт., 1995; Ефременко В. И., 1997; Жарникова И. В., 2004), а также при конструировании специфических сорбентов, используемых при лечении некоторых заболеваний (Гонтарь И.П. с соавт., 1998; Базиков И. А., 2000).

Расширение областей применения магнитных носителей, с одной стороны, способствует более детальному их изучению, с другой — предопределяет увеличение числа всевозможных методов их получения и конструирование на их основе новых диагностических препаратов для детекции возбудителей инфекционных заболеваний, обладающих высокой специфичностью и чувствительностью.

Способность отдельных фосфолипидов формировать в водной среде при встряхивании «пузырьки жира», представляющие собой жидкокристаллическую мембрану, в полости которой и снаружи находится водная фаза, впервые была описана в 1965 году А. Бенхемом с соавторами. Эти «пузырьки», напоминающие под электронным микроскопом клетки, получили в дальнейшем название липосомы (бислойные липидные везикулы).

К настоящему времени разработаны несколько десятков методов получения липосом с включением в их внутренний объем или структуру мембраны различных по природе и физико-химическим параметрам веществ, обеспечивающих при необходимости высокий процент их иммобилизации, а также эффективные способы отделения липосом от несвязавшихся компонентов, методы их стерилизации и стабилизации, позволяющие сохранять целостность мембран липидных везикул относительно длительное время в различных реакционных средах и биологических системах. При этом, гидрофильные вещества фиксируются во внутренний объем липидных везикул, а гидрофобные — в их мембрану.

Возрастающий интерес к липосомам обусловлен совокупностью их физико-химических и биологических свойств. Их химическая инертность, универсальность, отсутствие токсичных, антигенных свойств, доступность сырья, простота включения лигандов и т. д. открывают возможности получения диагностических препаратов нового поколения с сохранением физико-химических и иммунологических свойств включаемых в липосомы веществ.

В качестве маркера, включаемого во внутренний объём бислойных липидных везикул, используют красители, флуорохромы, ферменты, радиоактивные вещества, углеводы и т. д., которые регистрируют соответствующим методом по мере появления их в анализируемой смеси после выхода из липосом (Власова Г. С., Салов В. Ф., Торчилин В. П. с соавт., 1982; Закревский В. И., Подзолков В. В., Мельников В. А., 1983; Закревский В. И., 1985; Остро М. Д., 1987; Сюнамото Дзюдзо, Акиёси Кадзунари, Сато Тосинори, 1989; Владимцева И. В., Плеханова Н. Г., Смирнова В. И. с соавт., 1990; Ревенко Л. Г., Ротов К. А., Васильев В. П. с соавт., 1990; Ротов К. А., Климова И. М., Васильев В. П. с соавт., 1992; Литчфилд У. Д., Фрейтаг Д. У., 1998; Ефременко В. И., 1999; McDougall I.R., Dunnick J.K., McNamee M.G. et al., 1974; Leserman L.D.et al., 1984; Sunamato J. et al., 1987; Flechtner M.D. et al., 1990).

Иммобилизованный в липосомы материал оказывается защищённым липидной мембранной от действия неблагоприятных факторов внешней среды, благодаря чему увеличивается срок его годности арголис Л.Б., Бергельсон Л. Д., 1986; Mарголис Л.Б., 1987; Liposomes, 1980; Liposomes, 1988).

При этом в липосомы возможно включение маркёров, которые в своей молекуле не содержат функциональные группы, необходимые для ковалентного присоединения к различным биополимерам, что зачастую является обязательным при использовании других диагностических методов исследования. Благодаря этому чрезвычайно расширяется круг используемых маркёров, включаемых в липосомальные диагностические препараты. Высокая же чувствительность липосомальных диагностических систем достигается тем, что в липидные везикулы удаётся фиксировать значительное количество маркёра.

Способность липосом с иммобилизованным на их поверхности одним из фрагментов реакции «антиген-антитело» специфически фиксировать недостающий компонент и в присутствии сывороточного комплемента, подобно некоторым клеткам микроорганизма, нарушать целостность своей мембраны с высвобождением заключённого во внутренний объём везикул маркёра используется при разработке высокочувствительных диагностических методов комплемент-зависимого иммунного лизиса липосом. Данная реакция позволяет обнаруживать в исследуемых объектах специфические гаптены, антигены, антитела или комплемент.

Реакция на основе иммуноанализа липосом (LILA-liposome immune lysis assay), получившая название липосомальный анализ (ЛИА), может осуществляться как в прямом, так и в конкурентном вариантах. По простоте регистрации и возможности автоматизации она не уступает традиционным методам, а по чувствительности и быстроте ответа превосходит обычные радиоиммунный и иммуноферментный анализы (Ясуда Такудзи, 1986; Литчфилд У. Д., Фрейтаг Д. У., 1998; Сюнамото Дзюдзо, Акиёси Кадзунари, Сато Тоси-нори, 1989; Ефременко В. И., 1999; Vistnes A.I., 1984; Connor J. et al., 1985; Monrroe D., 1986 a; 1986 б; Jou Yi-Her et al., 1990).

В ряде случаев маркёры иммобилизируют на поверхности мембраны липосом. Иммобилизация ингредиентов иммунологической реакции (антигенов и антител) с липидной мембранной липосом представляет определённую трудность в связи с её гидрофобной природой. Описаны различные методы ковалентного связывания белковых молекул с наружной поверхностью липосомальной мембраны: посредством глутарового альдегида, перйодата натрия, галактозидазы (Chua M.M. et al., 1987; Yu B.S. et al., 1987). Образующиеся альдегидные группы связывали с поверхностью липосом посредством предварительно введённых гидразидных групп. Такой способ позволяет связывать до 60% добавленного в реакцию модифицированного белка (Владимцева И.В., 2002).

Иммобилизация рецепторных молекул гидрофобной природы, например, ганглиозидов, не представляется методически трудной, поскольку включение осуществляется путём совместного озвучивания в процессе приготовления липосом (Moss J., Fishman P.H., Richards R.L. et al., 1976 Masserini M., Sonnino S., Giuliani A., Tettamanti G. et al., 1984; Umeda M., Kanda S., Nojina S. et al., 1984).

В качестве твёрдой фазы при проведении липосомального иммуноанализа используют наносимые на твёрдую поверхность мазки из зева, содержащие Р-гемолитический стрептококк группы, А (Gerber M.A. et al., 1990), а также пластиковые пробирки, полимерные микроплаты, диски нитроцеллюлозной бумаги, стеклянные бусы, покрытые различными специфическими иммуноглобулинами.

Дополнительные преимущества данный метод приобретает при использовании твёрдофазных магнитных сорбентов, позволяющих легко сепарировать компоненты реакционной системы в магнитном поле и эффективно регистрировать анализируемые вещества. С помощью данного метода выявляют различные микроорганизмы и их антигены. В этом случае на магнитные сорбенты вначале фиксируют исследуемый материал за счёт специфической реакции «антиген-антитело», а затем липосомы. Освобождение маркёра, включённого в бислойные липидные везикулы, с последующей его количественной регистрацией осуществляют в присутствии органических растворителей, поверхностно-активных и других веществ, воздействием повышенной температуры, приводящих к лизису липидных мембран, после того, как не-связавшиеся с твёрдой фазой компоненты реакции удаляются, а липосомы за счёт специфических реакций остаются фиксированными на твёрдой поверхности (Ефременко В.И., 1999).

К. А. Ротовым с соавт. (1992) продемонстрирован метод обнаружения чумного микроба с использованием магнитных полиакриламидных гранул и радиоактивной метки, включённой в липосомы, на поверхности которых фиксировали иммуноглобулины. Метод позволил выявлять возбудитель чумы в концентрации 10 м.к./мл и 10 пг/мл фракции I чумного микроба.

И. В. Владимцевой (2002) разработаны биотехнологические аспекты конструирования диагностических тест-систем на основе МИС и люминесцируюших липосом, позволяющих выявлять 0,6+0,014 мкг чумных иммуноглобулинов и 15 нг/мл холерного энтеротоксина.

Из проведённого анализа литературных данных следует, что в настоящее время используется небольшое количество экспресс-методов, позволяющих выявлять микобактерии туберкулёза. Для достоверной диагностики туберкулёза рекомендовано проводить комплексное обследование больных с использованием нескольких методов, так как ни один из существующих анализов не может подтвердить диагноз во всех случаях болезни. Многие реакции громоздкие и сложные, а методы их постановки малорезультативны. В связи с этим продолжается поиск универсальных методов выявления туберкулезных антигенов и антител, замена существующих рутинных тестов на современные, высокоэффективные способы.