Контроль качества лекарственного препарата

Исследования проводили в Казанском государственном медицинском университете. Студентами и научным руководителем: И. А. Салахов, С. Ю. Гармонов, Р. Н. Исмаилова, Н. Г. Николаева, С. М. Горюнова.

Исследования проводили на жидкостном хроматографе LC-20 фирмы «Schimadzu» (Япония), состоящего из насоса для создания градиента высокого давления (LC-20AB), термостата колонок (CTO-20A), инжектора «Реодайн», вакуум-дегазатора, последовательно соединенных диодноматричного (SPD-M 20A) и флуоресцентного (RF-10AХl) детекторов. Обработку данных и запись хроматограмм осуществляли на персональном компьютере с помощью программного обеспечения LC Solution версии 1.22. Разделение проводили на колонке с обращенной фазой SymmetryС18 (4,6 мм х 150 мм х 5 мкм) с предколонкой Symmetry С18 (3,9 мм х 20 мм х 5 мкм). Подвижная фаза: канал, А — 0,05% раствор трифторуксусной кислоты в воде, канал В — ацетонитрил, работа насоса осуществлялась по следующей программе: изократический режим элюирования в течении 3 минут соотношение каналов А/В= 99,8/0,2; прямолинейный градиент в течении 10 минут, в результате которого содержание канала В достигало 55%, затем изократический режим элюирования в течении 2 минут при соотношении каналов А/В= 55/45. Время уравновешивая колонки между циклами программы составляло 5 минут при начальном соотношении каналов программы. Аналитические определения проводили в следующих условиях: скорость потока — 1,0 мл/мин, объем вводимой пробы — 20 мкл, температура термостата колонки 30 градусов по Цельсию (18).

Для приготовления элюентов использовали ацетонитрил ос. ч, метанол марки для хроматографии и сверхчистую воду, полученную на установке MilliporWaters (США) из бидистилированной воды. В качестве стандартов определяемых лекарственных веществ использовали субстанции аскорбиновой кислоты, парацетамола, хлорфенирамина малеата фармакопейной чистоты.

Методика выполнения анализа.

Для приготовления анализируемого раствора измельчают и растирают 5 таблеток Антигриппина. Отвешивают 0,3 г (точная навеска) порошка растертых таблеток, растворяют в деионизированной воде и переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, энергично встряхивают, обрабатывают ультразвуком 5 мин и доводят водой до метки. Перед вводом в колонку пробы фильтруют через мембранный фильтр с размером частиц 0,45 мкм. По 20 мкл исследуемого раствора и раствора стандартного образца с помощью микрошприца вводят в хроматограф. Массу определяемых веществ (в г) в одной таблетке вычисляют по формуле:

ХBг B=(СBа B? АBстB?М?К)/(СBстB?АBаB),.

где: СBа B — средняя концентрация по градуировочной зависимости или площадь пика соответствующих веществ в исследуемых образцах; АBст B — навеска соответствующих стандартных образцов; СBст B средняя концентрация по градуировочной зависимости или площадь пика соответствующих веществ в стандартных образцах; АBаB — масса навески исследуемого образца; М — средняя масса таблетки, найденная из массы 20 таблеток; К — коэффициент разбавления 0,0025; 0,5; 0,01; 0,1 для 4 аминофенола, парацетамола, хлорфенирамин малеата, аскорбиновой кислоты соответственно (8).

Результаты и их обсуждение В предварительных исследованиях на основании данных диодно-матричного детектора получены результаты по интенсивности светопоглощения определяемых соединений в интервале длин волн 190−600 нм. При этом максимумы поглощения аскорбиновой кислоты регистрировались при длине волны 242 нм, парацетамола — 243 нм, хлорфенирамина малеата — 263 нм. Длина волны 290 нм приемлема для определения парацетамола для снижения интенсивности отклика. В случае многоволнового детектирования или работы с переключением длин волн можно рекомендовать данные максимумы поглощения в качестве аналитических длин волн. Идентификацию определяемых веществ проводили по параметрам удерживания и спектрам поглощения, предварительно определенным на стандартных растворах. Для 4 аминофенола оптимальные параметры флуоресцентного детектора составили: длина волны возбуждения 260 нм, эмиссии 340 нм (7).

В процессе работы выполнена оптимизация пробоподготовки и хроматографических условий разделения. Как показали проведенные эксперименты, для полного извлечения компонентов таблеток Антигриппина достаточна их обработка водой с последующим воздействием ультразвуком. При выборе и обосновании условий хроматографического разделения мы использовали достоинства градиентного элюирования: сокращение общего времени анализа, улучшение разделения всей смеси и формы пиков, увеличение чувствительности для компонентов смеси, выходящих из колонки позже других. В связи с этим был использован метод обращено — фазной ВЭЖХ в режиме линейного градиента с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила и 0,05%-ного раствора трифторуксусной кислоты. Линейная форма градиента выбрана потому, что показана ее максимальная эффективность для обращено-фазных хроматографических систем с использованием ацетонитрила в качестве органического модификатора подвижной фазы. Повышенные требования к качеству растворителей при использовании градиентного режима позволяют уменьшить число и величину мешающих системных пиков на хроматограммах (22). Кроме того, применение высокочистых растворителей значительно продляет срок службы дорогостоящих хроматографических колонок, особенно при серийном фармацевтическом анализе. Типичная хроматограмма смеси анализируемых соединений приведена на рис. 1.

Рис. 1. Хроматограмма разделения активных веществ: 1 — 4-аминофенол 0,25 мкг/мл; 2 — аскорбиновая кислота 100 мкг/мл. Подвижная фаза: смесь 0,2% - ацетонитрил и 99,8% - 0,05% водного раствора трифторуксусной кислоты. Скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин. Длина волны возбуждения 260 нм, эмиссии 340 нм

При этих условиях хроматографирования время удерживания последнего компонента составляет 12 минут. При этом показана возможность количественного анализа трудноудерживаемой примеси 4-аминофенола в присутствии аскорбиновой кислоты на колонке SymmetryС18 одновременно с количественным определением действующих веществ працетамола, аскорбиновой кислоты и хлорфенирамина малеата (6).

Рис. 2. Хроматограмма разделения действующих веществ: 1 — аскорбиновая кислота 100 мкг/мл; 2 — парацетамол 500 мкг/мл; 3 — хлорфенирамина малеат. Подвижная фаза: ацетонитрил — 0,05% водный раствор трифторуксусной кислоты, градиентный режим элюирования. Скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин. Длина волны детектирования 263 нм

Рис. 3. Хроматограмма Антигриппина: 1 — аскорбиновая кислота 100 мкг/мл; 2 — парацетамол 500 мкг/мл; 3 — сахаринат натрия; 4 — хлорфенирамина малеат 6 мгк/мл. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,05% водный раствор трифторуксусной кислоты, градиентный режим элюирования. Скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин. Длина волны детектирования 263 нм

Рис. 4. Хроматограмма Антигриппина: 1 — аскорбиновая кислота 100 мкг/мл; 2 — парацетамол 250 мкг/мл; 3 — сахаринат натрия; 4 — хлорфенирамина малеат 5 мгк/мл. Подвижная фаза: ацетонитрил — 0,05% водный раствор трифторуксусной кислоты, градиентный режим элюирования. Скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин. Длина волны детектирования 263 нм

Достоверность результатов аналитического определения доказывается определением пригодности хроматографической системы и установлением критериев специфичности, правильности, точности, линейности диапазона количественного определения лекарственных веществ (25).

Данные по оценки пригодности хроматографической системы представлены в табл. 1. Как видно, при подобранных условиях разделения достигаются оптимальные значения времени удерживания компонентов, числа теоретических тарелок и симметрии пика. Хороший результат разделения компонентов смеси, достигнутый в предлагаемых условиях, отражается в и разрешающей способности. При этом значения коэффициентов разрешения (RBsB) для двух соседних пиков указывают на хорошее разделение соответствующих веществ.

При указанных рабочих условиях проведения анализа линейные, хорошо воспроизводимые градуировочные зависимости интенсивности сигнала (высота пика) — содержание определяемого вещества в записываются в виде уравнений: для парацетамола S (mAU?s) = 95 417 CBXB (мкг/мл) + 9805 (r = 0,9997, n = 15); для аскорбиновой кислоты S (mAU?s) = 22 650 CBXB (мкг/мл) + 1584 (r = 0,9996, n = 12); для хлорфенирамина малеата S (mAU?s) = 23 927 CBXB (мкг/мл) — 1793 (r = 0,9997, n = 14); для 4-аминофенола S (mAU?s) = 319 376 CBXB (мкг/мл) — 9833 (r = 0,9999, n = 16); для сахарината натрия S (mAU?s) = 10 445 CBXB (мкг/мл) — 1008 (r = 0,9995, n = 14).

Пределы обнаружения составляют для парацетамола, аскорбиновой кислоты, хлорфенирамина малеата, 4-аминофенола и сахарината натрия 0,2 мкг/мл; 0,5 мкг/мл; 0,4 мкг/мл 0,03 мкг/мл; 0,6 мкг/мл соответственно при интервале определяемых содержаний действующих и вспомогательных веществ 4 мкг/мл — 600 мкг/мл (24).

Оценка пригодности хроматографической системы (n=9).

Таблица 1.

Показатели пригодности хроматографической системы приведены в таблице 1. Специфичность методики оценивалась по совпадению времен удерживания анализируемых компонентов с соответствующими стандартами и по доказательству отсутствия влияния действующих и вспомогательных веществ на аналитические определения. При этом точность метода описывается метрологическими характеристиками в соответствии с рекомендациями фармакопеи. Результаты воспроизводимости оценивались при многократном анализе однородного аутентичного образца (табл. 2). На основании вышеизложенных данных можно утверждать, что диапазон 80% - 120% от номинально испытуемой концентрации (количества препарата) обеспечивает необходимые значения правильности, точности и линейности. Предварительно установлено, что вспомогательные вещества, входящие в состав таблеток, определениям не мешают (21).

Метрологические характеристики аналитических определений компонентов Антигриппина методом ВЭЖХ (P=95, n=9).

Таблица 2.

Экспериментально возможность хроматографического определения отдельных компонентов Антигриппина в анализируемых смесях проверена в различных модельных и готовых лекарственных формах (табл. 3,4). Оценка правильности подтверждается результатами анализа модельных смесей, представленных в таблице 4.

Результаты определения действующих веществ Антигриппина в модельных смесях (n=3).

Таблица 3.

Результаты анализа таблеток Антигриппина (промышленная серия 2 060 607) (n=5, Р = 0,95).

Таблица 4.

Таким образом, предложенная методика анализа обеспечивает получение достоверных и воспроизводимых результатов совместного обнаружения и количественного определения действующих веществ аскорбиновой кислоты, парацетамола, хлорфенирамин малеата и примеси 4-аминофенола, а также вспомогательного вещества сахарината натрия в шипучих таблетках Антигриппина для детей и для взрослых.