Лабораторная работа № 11. Получение и культивирование суспензии картофеля на средах с различными гормонами

Суспензионные культуры — это одиночные клетки, мелкие, средние и крупные агрегаты (группы клеток), выращиваемые в жидкой питательной среде при постоянной аэрации (доступ кислорода) в асептических условиях. Суспензии получают из каллусов. Для инициации суспензионной культуры необходимо 2—3 г свежей рыхлой массы каллусных клеток на 60—100 мл жидкой питательной среды. Первичную суспензию культивируют в колбах с жидкой питательной средой на круговых качалках со скоростью 100—120 об/мин. Кривая роста суспензии имеет S-образную форму и включает лаг-фазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу и фазу деградации. Форма ростовых кривых отличается продолжительностью фаз. Это зависит от генетики популяции, количества инокулюма и состава питательной среды. Скорость нарастания биомассы колеблется от 15 до 70 суток. Суспензии используют для получения различных химических веществ: органических кислот, ферментов, алкалоидов, красителей, белков, аминокислот. Их применяют в фармакологии, парфюмерии, пищевой и химической промышленности, сельском хозяйстве. Суспензионные культуры имеют большое значение для генетики и особенно молекулярной биологии: из суспензионных клеток получают протопласты, необходимые для соматической гибридизации, генетической инженерии, а также для изучения метаболизма клеток.

Цель работы: получить суспензионную культуру картофеля и изучить влияние различных гормонов на ее рост.

Оборудование и материалы: ламинар-бокс, колбы с питательной средой (МС + 3 мг/л 2,4-Д) для инициаций суспензии, круговые качалки, магнитные мешалки, стерильные инструменты, флакон с 96%-м спиртом.

Объект исследования: пробирки с рыхлыми каллусами картофеля.

Ход работы.

Приготовить питательные среды: а) МС + 3 мг/л 2,4-Д; б) МС + + 1 мг/л ИУК; в) МС + 3 мг/л 2,4-Д + 0,2 мг/л БАП; г) МС без гормонов.

В асептических условиях извлечь каллус из пробирки и поместить в колбу с питательной средой из расчета 2—3 г на 100 мл среды. Колбы с суспензией поместить на круговые качалки при 100—120 об/мин и оставить на три-четыре недели (для первого пассажа).

Пассирование суспензионной культуры осуществляют каждые две недели следующим образом: суспензии дают отстояться 1—2 мин и переливают 5—10 мл суспензии в колбу со свежей средой (обычно в пропорции 1: 10, т. е. в колбу емкостью 500 мл помещают 5 мл исходной суспензии и 45 мл свежей среды). Пересадив суспензию, ставят колбы на качалку до следующей пересадки.

Задание. Результаты культивирования суспензии зарисовать и сделать выводы о влиянии различных по составу сред на образование суспензионной культуры.