Использование молекулярных методов селекции на устойчивость к сетчатой пятнистости ячменя (обзор)

В последние годы в связи с усилением аридности климата произошло увеличение частоты эпифитотий листовых болезней ячменя. Поэтому в настоящее время значительно возросла необходимость создания устойчивых сортов. Внедрение методов маркерной селекции позволит существенно ускорить селекционный процесс на устойчивость к патогенам. Сотрудниками Всероссийского института защиты растений рекомендовано три гена Rpt 1b, Rpt 5, Rpt 6, контролирующих устойчивость к возбудителю сетчатого гельминтоспориоза, для использования в селекционных программах в условиях Северного Кавказа. Ген Rpt 5 является одним из самых высокоэффективных, поскольку детерминирует устойчивость к восьми изолятам гриба Pyrenophora teres различного происхождения. В 2011 году австралийскими учеными были выявлены микросателлитные маркеры Bmag0173 и HVM74, тесно сцепленные с геном Rpt5, которые весьма эффективно используются в целях маркер-вспомогательной селекции устойчивых сортов в Австралии и Канаде. В связи с актуальностью создания новых генотипов, несущих гены устойчивости к сетчатой пятнистости, эффективных в Южном федеральном регионе, сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского института зерновых культур им. И. Г. Калиненко и Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н. И. Вавилова была разработана практическая стратегия использования молекулярных методов для создания сортов ячменя, устойчивых к данному патогену, которая в настоящее время успешно осуществляется.

Ключевые слова: ЯЧМЕНЬ, СЕТЧАТАЯ ПЯТНИСТОСТЬ, МАРКЕРЫ, СТРАТЕГИЯ

Мировое производство продукции растениеводства, в том числе и в России ориентировано на ресурсосберегающие и экологически безопасные технологии. Базовой составляющей таких технологий является возделывание устойчивых к болезням сортов сельскохозяйственных культур. Ячмень — одна из самых уязвимых для болезней культур: известно более 40 возбудителей болезней и несколько типов неинфекционных заболеваний (Афанасенко О.С., 2013). Австралийскими исследователями был проведен анализ средних ежегодных потерь урожая ячменя от болезней за период 1998 — 2008, которые составили 252 Ч 10⁶$ или 19,6% урожая культуры (Murray G.M., 2009).

По мнению Н. М. Лашиной (2015), одним из лимитирующих факторов получения высоких урожаев качественного зерна фуражного ячменя в основ-ных зонах его возделывания являются болезни, вызываемые гемибиотрофными патогенами. В Южном федеральном округе наиболее опасной и вредоносной болезнью является сетчатая пятнистость (возбудитель — аскомицет Pyrenophora teres Drechs. (анаморф: Drechslera teres Sacc. (Shoem.) = Helminthosporium teres) (рис. 1).

Рис. 1. Сетчатая пятнистость ячменя

Согласно данным О. С. Афанасенко (1996), с начала 90-х годов прошлого столетия усиливается народно-хозяйственное значение сапрофитных патогенов растений, и в том числе, возбудителя сетчатой пятнистости листьев. Вредоносность болезней состоит не только в прямых потерях урожая из-за сниженного фотосинтеза растений, но и в снижении качества зерна, делающим его непригодным для получения солода в пивоваренной промышленности.

Кроме того, гемибиотрофные патогены являются токсинобразующими грибами, что усиливает их вредоносность как при патогенезе, так и при ис-пользовании ячменя в пищевой, пивоваренной промышленности и в кормо-производстве (Лашина Н.М., 2015).

Название «сетчатая пятнистость» обусловлена симптомом сетки, обра-зующейся на листьях ячменя: на листьях взрослых растений образуются узкие, темно-коричневые некрозы в виде полосок, состоящих из продольных и поперечных коричневых штрихов, образующих рисунок сетки. Кроме листьев гриб поражает листовую обертку, стебель и колос растений. Сильное поражение приводит к полной некротизации листьев и их усыханию, что яв-ляется причиной снижения массы зерна. Вредоносность болезни проявляется также в уменьшении числа колосьев на растении и числа зерен в колосе. На Северном Кавказе эпифитотии возникают 4−5 раз в течение 10 лет; потери урожая при эпифитотии могут достигать 36,8−45% (Агроэкологический атлас России).

В связи с изменением климатических условий в Южном федеральном округе в сторону потепления увеличилась частота эпифитотий листостебель-ных болезней. В результате значительно возросла значимость устойчивого сорта в интегрированной борьбе с возбудителями болезней ячменя. Селекция на устойчивость к патогенам является наиболее экономичным и экологически чистым методом борьбы с болезнями (Кузнецова Т.Е. и др., 2006).

По мнению А. В. Анисимовой (2006), создание коллекций источников устойчивости ячменя к листовым пятнистостям является базовой работой при целенаправленной селекции устойчивых сортов. Для успешной селекции ячменя на устойчивость к сетчатому гельминтоспориозу необходимы генети-чески охарактеризованные доноры устойчивости. Несмотря на то, что изучение генетического контроля ячменя к сетчатой пятнистости за рубежом и в нашей стране проводится уже на протяжении нескольких десятилетий, в су-ществующей генетической коллекции доноров устойчивости лишь небольшое число генов устойчивости продолжает оставаться высокоэффективными.

Все основные стратегии создания генетически защищенных сортов сельскохозяйственных культур базируются на наличии генетического разно-образия устойчивости, так как возделывание сортов с высокоэффективными генами устойчивости на больших территориях, неизбежно при-водит к потере устойчивости вследствие микроэволюционных процессов в популяциях паразитов. В связи с этим потребность практической селекции в новых генах устойчивости является постоянной (Афанасенко О.С., 2013).

С появлением новых технологий молекулярного картирования и секве-нирования значительно расширились возможности селекции растений на устойчивость к болезням, так как появился новый мощный инструмент контроля передаваемого признака устойчивости — молекулярные маркеры. Маркер-вспомогательная селекция (marker assisted selection — MAS) растений на устойчивость к болезням в настоящее время широко используется в Европе, США, Канаде, Австралии (Афанасенко О.С. и др., 2014). С разработкой молекулярных маркеров в селекции растений на устойчивость к болезням появился уникальный шанс не только ускорить процесс селекции и снизить затраты на многолетние испытания, но и направить усилия на создание сортов с длительной и групповой устойчивостью, за счет объединения в одном генотипе определенных комбинаций генов, детерминирующих устойчивость к одной болезни или к разным патогенам. По мнению О. С. Афанасенко (2013) тради-ционной селекцией эту проблему решить практически невозможно, так как создание конвергентных сортов традиционными методами требует неодно-кратного проведения анализирующих скрещиваний для определения числа генов, переданных после каждого скрещивания. Этот процесс может рас-тянуться на десятилетия, поэтому данный метод не нашел применения в се-лекции.

Основной принцип MAS заключается в идентификации тесного сцеп-ления между маркером и геном, контролирующим признак, и использовании ассоциаций «маркер-признак» в практических целях для создания новых сортов и селекционных линий. После того как ассоциации «маркер-признак» установ-лены, создание новых генотипов может идти с привлечением традиционных методов селекции (скрещивание, беккросирование, самоопыление и отбор). В сочетании с методами классической селекции MAS существенно сокращает время, необходимое для создания новых генотипов. Так при использовании стратегии MAS для интрогрессии признака устойчивости к ржавчине в элитный сорт мягкой пшеницы Stylet на создание устойчивого сорта понадобилось 5 лет, что оказалось на 7 лет меньше, чем при получении сорта с помощью традиционных методов селекции (Леонова И.Н., 2013).

Гены и QTL, детерминирующие устойчивость к возбудителю сетчатой пятнистости ячменя Pyrenophora teres f. teres были локализованы почти на всех хромосомах ячменя: 1H, 2H, 2HS, 2HL, 3HL, 4H, 5H, 6HL, 7H (Афанасенко О.С., 2013).

В работах различных исследователей на хромосоме 6Н был локализован ген, детерминирующий устойчивость к P. teres f. teres у сортов Steptoe (Steffenson B.J. et al, 1996), TR 306 (Spaner D.S.L. et al, 1998), Kaputar (Cakir M. et al, 2003), Chevron (Ma Z.Q. et al, 2004), ND11231*12 (Emeberi L.C. et al, 2005) и Pompadour (Gupta S. et al, 2010). По мнению многих авторов в этом районе хромосомы 6Н имеется кластер из нескольких генов устойчивости к P. teres f. Teres (Qamar A. et al, 2008, Gupta S. et al, 2010, Manninen O. et al, 2006).

По данным Mode C.Y. et al (1958) устойчивость сортов Ming, Harbin и Manchuria (CI 2335) контролируется одним общим геном Pt2.

Установлено также, что сортообразцы Canadian Lake Shore и CI 4922 несут 2 дупликатных гена устойчивости (Pt2 и Pt3) (Лашина Н.М., 2015).

О.С. Афанасенко с соавт. (2000) была обоснована стратегия территори-ального размещения генов устойчивости ячменя, основанная на данных о пространственном распределении популяций возбудителя сетчатой пятнисто-сти и эффективности генов устойчивости к различным популяциям паразита. Сотрудниками ВИЗР предложено использование как мозаики генов устойчи-вости, так и одного эффективного гена на большой территории. Для условий Северного Кавказа рекомендовано использование в селекционных программах на устойчивость к сетчатой пятнистости три эффективных гена: Rpt 1b, Rpt 5, Rpt 6. молекулярный пятнистость ячмень селекция Высокоэффективный ген Rpt 5, детерминирующий устойчивость к воз-будителю сетчатой пятнистости у эфиопского образца ячменя CI 9819, был картирован сотрудниками ВИЗР совместно с коллегами из Финляндии (Manninen O. et al, 2006). Анализ дигаплоидов с использованием 6 типов ДНК-маркеров позволил выявить этот доминантный ген, эффективный против восьми изолятов гриба различного происхождения (из США, Великобритании, Финляндии и Канады), в хромосоме 6Н (Афанасенко О.С., электронный ресурс).

Гриб Pyrenophora teres существует в двух формах: P. teres f. teres, вызывающей симптомы типично сетчатых пятен (net type), и P. teres f. maculate, вызывающей симптом округлой пятнистости (spot type). В Южном федеральном округе наиболее вредоносен net type Pyrenophora teres.

В 2011 году группа австралийских ученых определила 10 сцепленных маркеров (Bmag0807, Bmag0173, HVM74, Bmag0870, HVM65, Bmag0496, Bmag 0344a, EBmac0853, EBmac0806 и EBmac0874), которые можно использовать при селекции на устойчивость к нет-типу сетчатой пятнистости. У маркеров Bmag0173 и HVM74 выявлена достоверная связь с устойчивостью к нет-типу сетчатой пятнистости (Gupta S. et al., 2011) (рис. 2).

Рис. 2. Расположение гена устойчивости к net-типу Pyrenophora teres и фланкирующих маркеров на 6 хромосоме ячменя по Gupta et al., 2011

Микросателлитные маркеры Bmag0173 и HVM74, тесно сцепленные с геном Rpt5, весьма эффективно используются в целях маркер-вспомогательной селекции устойчивых сортов в Австралии и Канаде.

В связи с актуальностью создания новых генотипов, несущих гены устойчивости к сетчатой пятнистости, эффективные в Южном федеральном регионе в отделе селекции ячменя ФГБНУ ВНИИЗК им. И. Г. Калиненко совместно с сотрудниками ФГБНУ ВНИИР им. Н. И. Вавилова была разработана практическая стратегия использования молекулярных методов для создания сортов ячменя, устойчивых к сетчатой пятнистости:

• 1) выявление генетического контроля устойчивости ячменя к сетчатой пятнистости в условиях Южного федерального округа;
• 2) испытание возможностей использования молекулярных маркеров, сцепленных с эффективными генами устойчивости, для маркер-вспомогательной селекции;
• 3) создание коллекции доноров для последующего использования при создании устойчивых сортов для Южного федерального округа.

Для реализации данной стратегии были поставлены следующие задачи:

• — установить, является ли ген Rpt5 эффективным в плане устойчивости ячменя к сетчатой пятнистости в условиях Южного Федерального округа;
• — установить, является ли система микросателлитных маркеров, рекомендованная в качестве инструмента маркер-вспомогательного отбора устойчивых форм в Канаде и Австралии, также эффективной и в условиях Южного федерального округа РФ;
• — выявить источники других возможных эффективных генетических локусов, обеспечивающих устойчивость ячменя к местным популяциям возбудителя Pyrenophora teres.

В результате проведенной работы будет установлена взаимосвязь анализируемых маркеров с изменчивостью по устойчивости к сетчатой пятнистости. В случае получения статистически достоверных данных будут выявлены те аллели, которые маркируют устойчивые сорта.

• 1. Агроэкологический Атлас России и сопредельных государств: сельскохозяйственные растения, их вредители, болезни и сорняки // Болезни сельскохозяйственных культур. — URL: http://www.agroatlas.ru/ru/content/diseases/Hordei/Hordei_Pyrenophora_teres/index.html (дата обращения: 13.11.2015).
• 2. Анисимова, А. В. Характеристика генетического разнообразия ячменя по устойчивости к возбудителям пятнистостей листьев и создание исходного материала для селекции [Текст]: автореф. дис. … канд. биол. наук. — Санкт-Петербург-Пушкин, 2006. — 19 с.
• 3. Афанасенко, О. С. Изменчивость популяций возбудителей гельминтоспориозных пятнистостей ячменя и генетический контроль устойчивости к Pyrenophora teres Drechs. [Текст]: автореф. дис. … доктора биол. наук. — Санкт-Петербург: Всероссийский НИИ защиты растений, 1996. — 41 с.
• 4. Афанасенко, О. С. Иммунологические основы селекции зерновых культур и картофеля на устойчивость к болезням [Текст] / О. С. Афанасенко, М. М. Левитин, Л. А. Михайлова, В. А. Колобаев, Т. Ю. Гагкаева // Вестник защиты растений. — 2000. — № 1. — С. 3−10.
• 5. Афанасенко, О. С. Современное состояние исследований генетики устойчивости ячменя к болезням [Текст] / О. С. Афанасенко // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. — 2013. — Т. 171. — С. 3−8.
• 6. Афанасенко, О. С. Картирование локусов, контролирующих устойчивость ячменя к различным изолятам Pyrenophora teres f. teres и Cochliobolus sativus [Текст] / О. С. Афанасенко, А. В. Козьяков, П. Хедлэй, Н. М. Лашина, А. В. Анисимова, О. Маннинен, М. Ялли, Е. К. Потокина // Вавиловский журнал генетики и селекции. — 2014. — Т. 18. — № 4/1. — С. 751−764.
• 7. Афанасенко, О. С. Проблемы создания сортов сельскохозяйственных культур с длительной устойчивостью к болезням. — URL: http://www.z-i-k-r.ru/interest/interestafanasenko.html (дата обращения — 13.11.2015).
• 8. Кузнецова, Т. Е. Селекция ячменя на устойчивость к болезням в условиях Северного Кавказа [Текст]: автореферат дис. … доктора с.-х. наук. Краснодар: Всероссийский научно-исследовательский институт риса. — 2006. — 52 с.
• 9. Лашина, Н. М. Создание дигаплоидов ячменя как исходного материала для селекции сортов с групповой устойчивостью к болезням [Текст]: автореферат дис. … канд. биол. наук. — Санкт-Петербург: Всероссийский НИИ защиты растений. — 2015.
• 10. Леонова, И. Н. Молекулярные маркеры: использование в селекции зерновых культур для идентификации, итрогрессии и пирамидирования генов [Текст] // Вавиловский журнал генетики и селекции. — 2013. — Т. 17. — № 2. — С. 314−325.
• 11. Abu Qamar, M. A region of barley chromosome 6H harbors multiple major genes associated with net type net blotch resistance [Текст] / M. Abu Qamar, Z.H. Liu, J.D. Faris et. al. // Theor. Appl. Genet. — 2008. — V. 117. — No. 8. — P. 1261−1270.
• 12. Cakir, M. Mapping and validation of the genes for resistance to Pyrenophora teres f. teres in barley (Hordeum vulgare L.) [Текст] / M. Cakir, S. Gupta, G.J. Platz et. al. // Aust. J. Agric. Res. — 2003. — V. 54. — P. 1369−1377.
• 13. Emebiri, L.C. Disease resistance genes in a doubledhaploid population of two-rowed barley segregating formalting quality attributes [Текст] / L.C. Emebiri, G. Platz, D.B. Moody // Aust. J. Agric. Res. — 2005. — V. 56 (1). — P. 49−56.
• 14. Gupta, S. Quantitative trait loci and epistatic interactions in barley сonferring resistance to net type net blotch (Pyrenophora teres f. teres) isolates [Текст] / S. Gupta, C.D. Li, R. Loughman et. al. // Plant Breed. — 2010. — V. 4. — P. 268−362.
• 15. Gupta, S. Identifying genetic complexity of 6H locus in barley conferring resistance to Pyrenophora teres f. teres [Текст, рисунок] / S. Gupta, Li C., Loughman R., Cakir M., Westcott S., Lance R. // Plant Breeding. — 2011. — P. 423−429.
• 16. Ma, Z.Q. QTL mapping of net blotch resistance genes in a doubled-haploid population of six-rowed barley [Текст] / Z. Ma, Q. N.L.V. Lapitan, B. Steffenson // Euphytica. — 2004. — V. 137. — P. 291−296.
• 17. Manninen O. Mapping of major spot type and net type net blotch resistance genes in the Ethiopian barley line CI 9819 [Текст] / O. Manninen, M. Jalli, R. Kalendar, O. Afanasenko, J. Robinson // Genome. — 2006. — V. 49. -P. 1564−1571.
• 18. Mode, C. Y. Two additional factors for host resistance to net blotch in barley [Текст] / C. Y. Mode, C.W. Schaller // Agron. J. — 1958. — V. 50. — P. 15−18.
• 19. Murray, G. M. Estimating disease losses to the Australian barley industry [Текст] / G. M. Murray, J. P. Brennan // Australasian Plant Pathology. — 2009. — V. 39(1). — P. 85−96.
• 20. Spaner, D.S.L. Mapping of disease resistance loci in barley on the basis of visual assessment of naturally occurring symptoms [Текст] / D.S.L. Spaner, T.M. Falak, I. Choo et. al. // Crop Sci. — 1998. — V. 38. — P. 843−850.
• 21. Steffenson, B.J. Genetics of seedling and adult plant resistance to net blotch (Pyrenophora teres f. teres) and spot blotch (Cochliobolus sativus) in barley [Текст] / B.J. Steffenson, P.M. Hayes, A. Kleinhofs // Theor. Appl. Genet. — 1996. — V. 92. — P. 552−558.