Описание технологического процесса производства незаменимой аминокислоты L — лизина

Стадии получения незаменимой аминокислоты L — лизина, представлена на рис. 3.3.2. Для промышленного производства, сначала нужно сконструировать плазмиду, которая будет отвечать за синтез аминокислоты с большим выходом и подобрать штамм продуцент, в нашем случае это E. Coli. Перед началом культивирования этой бактерии, нужно нарастить в лабораторных условиях достаточное количество нужной биомассы. Провести контроль продуцента, и проверить морфологию на наличие патогенных организмов. Питательные среды, которые используются для наращивания продуцента в лабораторных условиях, должны быть идентичны в промышленном культивировании. Это нужно для того, чтобы штамм успел адаптироваться к этим условиям и смог производить большое количество нашей аминокислоты.

Описание технологического процесса получения L — лизина

1. Конструирование рекомбинантной ДНК Рекомбинантная ДНК несет в себе дикий или вариантный dapA ген штамма В. subtilis, и автономно реплицирует его в бактериальном штамме Escherichia. Рекомбинантная ДНК может быть получена путем вставки фрагмента ДНК, содержащего dapA ген бактерии В. subtilis, в экспрессионный вектор воспроизводимого (реплицируемого) бактериального штамма Escherichia.

DapA ген экспрессируют из штамма В. subtilis, и соответствующая DDPS (дигидродипиколинатсинтаза)не испытывает существенного ингибирования по типу обратной связи L-лизином. Выбранный штамм В. subtilis сам по себе может быть производителем L-лизина или не быть им. Предпочтительным штаммом В. subtilis является штамм W168, который не производит лизин.

Фрагмент ДНК, содержащий dapA ген дикого типа бактерии В. subtilis (BsdapA ген) может быть получен из хромосомной ДНК штамма В. subtilis дикого типа. Фрагмент ДНК может быть получен путем амплификации dapA гена дикого типа бактерии В. subtilis из хромосомной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Последовательности нуклеиновых кислот праймеров SEQ ID NO 3 и NO 4 представлены ниже:

Фрагмент ДНК, содержащий дикий или вариантный dapA ген бактерии В. subtilis, может быть впоследствии дотирован (замкнут) с подходящим экспрессионным вектором для получения рекомбинантной ДНК, содержащей dapA ген. Подходящий экспрессионный вектор ДНК автономно реплицируется в бактериальном штамме Escherichia и содержит селектируемый генетический маркер. Селектируемый генетический маркер может продемонстрировать устойчивость к антибиотикам, изменение цвета или любых других характеристик, по которым можно отличить трансформированные участки от нетрансформированных.

Примеры подходящих векторов включают экспрессионные векторы Е. coli, такие как pTrc99A, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 и pSTV28. Желательно, чтобы фрагмент ДНК внедрялся в экспрессионный вектор ДНК так, чтобы dapA ген находился под контролем сильного промотора Е. coli. Примеры подходящих промоторов включают trc, tac, lac и Т7, лучше всего trc.

2. Трансформирмация бактерии Escherichia.

Бактерия Escherichia может быть трансформирована при помощи рекомбинантной ДНК, содержащей дикий или вариантный dapA ген бактерии В. subtilis, с использованием стандартных методов. Родительская (нетрансформированная) бактерия Escherichia может нести дикий или мутантный природный dapA ген, и экспрессировать соответствующую DDPS дикого или мутантного природного типа. Ферментативная активность природных DDPS может испытывать ингибирование по типу обратной связи L-лизином.

Родительская бактерия Escherichia может быть производителем L-лизина. Активность другого природного фермента, участвующего в биосинтезе лизина, может быть повышена. Например, можно использовать штамм Е. coli, содержащий ДНК, кодирующую природную аспартокиназу III и имеющую мутации, для десенсибилизации к ингибированию L-лизином по типу обратной святи. Предпочтительно использовать такой штамм бактерии Escherichia, как Е. coli.

После преобразования, бактерия Escherichia получает дикий или вариантный dapA ген бактерии В. subtilis. Наличие dapA гена бактерии В. subtilis в преобразованной бактерии определяется с помощью стандартных методов, известных специалистам в данной области. DapA ген бактерии В. subtilis может быть перенесен на плазмиду. Он также может быть интегрирован в хромосому трансформированной бактерии Escherichia. Трансформированная бактерия Escherichia производит L-лизин в достаточно больших количествах (не менее 25, 50, 75, 100, 125 или 150 г/л).

В одном варианте, штамм Е. coli B-3996 (доступен в Исследовательском институте генетики и промышленного скрещивания микроорганизмов, регистрационный номер RIA 1867) трансформируют с помощью рекомбинантной ДНК, содержащей dapA ген дикого типа (напр., pTrc99A-BsdapA), после удаления одиночной плазмиды pVIC40 (Патент США № 6,040,160), и получают трансформированный бактериальный штамм B-399/pTrc99A-BsdapA. Контрольный штамм В-399/pTrc99A получают таким же образом, с помощью трансформации соответствующей рекомбинантной ДНК без BsdapA (напр., pTrc99A).

В другом варианте, штамм бактерии Е. coli DC037, взятый в компании Global Bio-Chem Technology Group Company Limited, используется для приготовления рекомбинантной бактерии Е. coli, содержащей dapA ген дикого типа бактерии В. subtilis (DC051), рекомбинантной бактерии Е. coli, содержащей H119Y вариантный dapA ген бактерии В. subtilis (DC231) и контрольной рекомбинантной бактерии Е. coli (DC073), которые производят L-лизин в количествах 150, 180 и 20 г/л, соответственно. Процессы приготовления и тестирования этих рекомбинантных штаммов Е. coli описаны в Примерах 3 и 4.

Бактериальные штаммы DC051 и DC231 были зарегистрированы 26 февраля 2009 г. Китайским центром хранения культур общей микробиологии (China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC) согласно Будапештскому договору и получили номера CGMCC № 2923 и CGMCC № 2924, соответственно.

Активность DDPS у бактерий измеряется по методу, описанному у Yugari, Y. и Gilvarg С. в J. Biol. Chem., 1965, 240(12):4710−16, или по любому другому приемлемому методу. Например, экстракт с бактериями добавляют в реакционный раствор, содержащий 50 µм имидазола-HCl (рН 7,4), 20 µм L-аспарагинового полуальдегида и 20 µм пирувата натрия, и инкубируют при 37 °C в течение 10 мин. Реакционный раствор без пирувата натрия может быть использован как бланковый. Активность DDPS измеряется по количеству дигидродипиколината, образованного в ходе реакции, который отслеживается с помощью спектрофотометра при длине волны 270 нм. Различные количества L-лизина добавлялись к реакционной смеси для оценивания чувствительности к нему со стороны активности DDPS.

3. Способ получения L-лизина.

L-лизин может быть получен при выращивании бактерий Escherichia, содержащих дикий или вариантный dapA ген бактерии В. subtilis, в среде для культивирования. Желательно использовать среду, подходящую для оптимального роста бактерий Escherichia (Anastassiadis, S., Recent Patents On Biotechnology 2007, 1(1):11−24). Также желательно добавлять в среду антибиотики (например, ампициллин) для поддержания селективности и стабильности трансформированных бактерий Escherichia.

Желательно соблюдать оптимальные для Escherichia условия культивирования. Культивацию предпочтительно осуществлять в аэробных условиях при температуре между 25 °C и 45 °C и уровне рН между 5 и 8. Концентрация L-лизина достигает максимума через 2−10 дней после начала культивации. Рост бактерий отслеживается на основании плотности клеток в среде для культивирования, которая измеряется спектрофотометром.

Перед сбором L-лизину дают накопиться в среде для культивирования трансформированной бактерии Escherichia, выращиваемой в соответствии с настоящим изобретением. Сбор L-лизина осуществляется с использованием различных методов (например, ионообменных хроматографических методов) для получения L-лизин-HCl до или после сепарации клеток путем центрифугирования и фильтрации культивационной среды; также можно собирать L-лизиновый бульон, из которого получают L-лизин сульфат в процессе пеллетизации (гранулирования).

Собирать L-лизин из среды для культивирования разрешается, когда его концентрация достигает как минимум 5−10 г/л, либо — в крупномасштабных ферментационных процессах — не менее 25, 50, 75, 100, 125 или 150 г/л, лучше всего 50 г/л. Количество полученного L-лизина определяется с использованием общепринятых аналитических методов (напр., ВЭЖХ).

4. Проблемы и перспективы получения незаменимой аминокислоты L — лизина Лизиновое производство — несет в себе необходимость создания сырьевой базы, оборудования, отработка с потребителем наиболее эффективных товарных форм продукта и способов его применения. Кроме того, индустриальное производство может быть устойчивым в том случае, если не только строго регламентируется технологический режим, но и обеспечивается необходимая стандартность сырья. В микробиологическом производстве это особенно важно, т.к. в данном случае одним из основных факторов служит адаптация микроорганизмов к питательной среде.

Вопросам увеличения выхода лизина и интенсификации процесса его получения посвящено значительное количество работ. Производительность промышленного биореактора существенно зависит от соотношения длительности стадий наращивания биомассы продуцента и биосинтеза целевого продукта. Сокращение длительности первой стадии процесса может быть достигнуто путем увеличения исходной плотности культуры.

Достижение максимально возможной плотности посевного материала желательно было обеспечить при минимальном приборном оснащении и не значительных дополнительных трудозатратах. Однократное увеличение содержания питательных веществ в исходной среде не дает положительных результатов, поскольку концентрация редуцирующих веществ более 2,0% уже частично ингибирует процесс роста продуцента.

Эффек ингибирования при этом обусловлен, по-видимому, интенсивным образованием побочных продуктов в условиях избытка сахаров относительно, количества, потребляемого системами транспорта кислорода. Поэтому начальная концентрация редуцирующих веществ в культуральной жидкости продуцентов лизина не должна превышать 1,9%. Однако такой низкий запас питательных веществ не позволяет получить желаемую плотность биомассы без дополнительных подпиток, которые так же не выгодно использовать в производстве. С другой стороны при реализации подпиток происходит постепенное снижение рН культуральной жидкости, приводящее к угнетению роста культуры. Снижение рН культурально жидкости при производстве лизина может быть связано со способностью продуцентов выделять молочную кислоту, что в условиях происходит лимитирования кислорода. В этом случае наблюдается неполное окисление субстрата с образованием кислот, которое может быть предотвращено или уменьшено на стадии приготовления инокулята и посевного материала рядом способов[1].

Проводя патентный поиск, проблемами получения лизина были:

• 1. Правильный подбор штаммов — продуцентов
• 2. Конструирование плазмиды
• 3. Приготовление питательной среды
• 4. Условия культивирования штамма — продуцента
• 5. Увеличение синтеза лизина
• 6. Получение большого выхода готового продукта

Единственный способ улучшить производство L-лизина бактерией Escherichia — преодолеть ингибирование DDPS L-лизином по типу обратной связи. Чтобы уменьшить восприимчивость DDPS к L-лизину, была предпринята попытка создать мутацию в гене dapA дикого типа у Escherichia bacterium [8]. При получении лизина необходимо исключить нежелательные побочные процессы. Так, при недостаточной аэрации может идти образование аланина или молочной кислоты вместо синтеза лизина. Очень важным фактором является концентрация дефицитных аминокислот — гомосерина, метионина и треонина в среде.