Активация функциональных групп на поверхности частиц полимерной суспензии

Требования к методам активации функциональных групп на поверхности частиц полимерные суспензии.

• · проходить необратимо и количественно при возможно более мягких условиях;
• · не уменьшать стабильность суспензий, не оказывать заметного влияния на их диаметр и РЧР;
• · сохранять биохимическую активность молекул биолиганда, ковалентно связанного с функциональными группами на поверхности частиц суспензии.

Карбоксильные группы

Карбоксильные группы на поверхности частиц суспензии могут вступать во взаимодействие с аминогруппами биополимера в присутствии водорастворимых карбодиимидов (ВРК) [80]. Наиболее часто используемыми ВРК являются: 1-циклогексил-3(2-морфолиноэтил) карбодиимидтолуолсульфонат (6) и 1-этил (3-диметиламинопропил) карбодиимидгидрохлорид (7).

Реакция активации протекает по следующей схеме:

Реакцию проводят при температуре 4−6°С и pH=6−7 в течении 2−4 часов в отсутствие или в присутствии инертного буфера типа N-2-гидроксиэтил пиперазин-N-этан сульфоновой кислоты.

К преимуществам данного способа активации функциональных групп следует отнести его простоту, однако вследствие того, что белковые молекулы содержат как карбоксильные, так и аминогруппы, возможно протекание межи внутримолекулярного сшивания, что снижает иммунохимическую активность биолиганда [26,104,127,128].

В значительной степени этот недостаток устраняется путем использования двухстадийных методов активации: на первой стадии карбоксильные группы переводятся в активную (но стабильную) форму, микросферы отделяются от дисперсной среды с оставшимися в ней не прореагировавшими компонентами, а затем, на второй стадии, проводят ковалентное связывание с биолигандами.

Среди наиболее распространенных 2-х стадийных методов активации функциональных групп можно назвать так называемый метод «активированных эфиров». Схема протекания процесса активации по работам [2,48,49] выглядит следующим образом:

Кроме N-гидроксибензотриазола могут быть использованы 1-гидроксибензтриазол, N, N-диалкилгидроксиламины и т. д. Условия протекания первой стадии аналогичны описанным выше для «карбодиимидного» метода. После первой стадии проводится очистка суспензии от побочных продуктов. Вторая стадия протекает при температуре 4^оС и pH =7−7,5 в течение 2−3 дней, после чего проводят полную очистку полученного диагностикума от примесей.

Другим возможным способом проведения активации по 2-х ступенчатой схеме, согласно [69], может быть использование реактива Вудворда: N-этил 5-фенилизоксазолин 3'-сульфоната.

В этом случае первая стадия протекает при pH=8,5 температуре 3^оС в течение 3 часов. Получение суспензии с активированными карбоксильными группами на поверхности частиц очищают от побочных продуктов и затем проводят связывание с биолигандами при pH =7, температуре 5^оС в течение 3 часов.

Общим недостатком перечисленных выше методов является высокая стоимость и малая стабильность при хранении используемых реактивов, что делает процесс связывания биомолекул с функциональными группами микросфер плохо воспроизводимым. Кроме того, при использовании указанных методов, биомолекулы оказываются расположенными вблизи поверхности полимерных частиц что может привести к изменению их конформации и уменьшить их биохимическую активность. В связи с этим, распространение получил также метод ведения спейсера в результате реакции карбоксильных групп частиц суспензии с различными диаминами (1,6 диаминогексаном, 1,7 диаминогептаном [47,90−93]. На первой стадии проводят связывание карбоксильных групп на поверхности микросфер с диамином в присутствии ВРК, после чего проводят активацию образовавшихся аминогрупп одним из методов, которые описаны ниже.