Иммобилизованные полиферментные системы

Первая искусственная биферментная система, включающая ковалентно связанные с носителем иммобилизованные ферменты — гексокиназу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, была создана в 1970 г. К. Мосбахом. В настоящее время известно несколько десятков иммобилизованных полиферментных систем, состоящих из двух, трех, четырех и более энзимов. Эффективность таких комплексов намного выше, чем у свободных ферментов, за счет локального концентрирования субстрата около второго и всех последующих ферментов, входящих в систему.

Иммобилизованные полиферментные системы применяют в промышленных технологиях, иногда — в научных исследованиях при изучении метаболизма клеток, транспортных процессов и т. д. Следует, однако, отметить, что результаты, полученные с помощью таких систем, не всегда правильно отражают процессы, происходящие в клетках. Это объясняется тем, что в живых клетках комплексы энзимов чаще всего располагаются упорядоченно в мембранах клетки, что позволяет регулировать скорость протекания ферментативных процессов, тогда как в полиферментных комплексах иммобилизованные ферменты связываются с носителем случайным образом.

Современные методы иммобилизации позволяют создавать не только полиферментные комплексы, связывать с носителями удается субклеточные структуры и даже целые клетки. Такие системы очень удобны, поскольку можно, не выделяя чистые ферментные препараты, получать естественные полиферментные системы, осуществляющие многостадийные процессы.

Биосенсоры

Биосенсоры — это аналитические устройства, в которых чувствительный слой, содержащий биологический материал, реагирует на присутствие определяемого компонента и генерирует электрический сигнал, функционально связанный с наличием и концентрацией этого вещества. Биоматериалом могут служить ферменты, ткани, бактерии, дрожжи, антигены/антитела, липосомы, органеллы, рецепторы, ДНК, а также клетки, которые иммобилизованы на физических датчиках. Следовательно, биосенсорная технология сочетает в себе достижения биологии и современной микроэлектроники.

Идея создания такого рода устройств возникла сравнительно недавно, в 1960;х гг. Впервые ее высказали Л. Кларк и К. Лионе в 1967 г. Идея Кларка состояла в использовании ферментного электрода, т. е. электрохимического датчика с иммобилизованным на его поверхности ферментом. Затем в обиход вошло понятие «биосенсор».

Большинство биосенсоров используется для анализа биологических жидкостей. Так, в крови находятся тысячи различных соединений, и бывает необходимо быстро и эффективно определить концентрацию нужного соединения, например глюкозы. Для людей, страдающих диабетом, это жизненно важный клинический анализ. Биосенсоры обеспечивают такую возможность.

Функционально биосенсоры сопоставимы с датчиками живого организма — биорецепторами, способными преобразовывать все типы сигналов, поступающих из окружающей среды, в электрические.

Принципы конструирования биосенсоров. Конструктивно биосенсор представляет собой устройство, состоящее из двух преобразователей, или трансдьюсеров, — биохимического и физического, находящихся в тесном контакте друг с другом (рис. 7.4).

Биохимический преобразователь сигнала (или биотрансдьюсер, биоселектор) выполняет функцию биологического элемента распознавания, преобразуя определяемый компонент (а точнее, информацию о химических связях) в физическое или химическое свойство или сигнал. В этом качестве выступают все типы биологических структур: ферменты, антитела, рецепторы, нуклеиновые кислоты и даже живые клетки.

Рис. 7.4. Схема биосенсора (по С. Д. Варфоломееву, 1997).

Физическии преобразователь сигнала (или трансдъюсер) преобразует определяемый компонент (а точнее, концентрационный сигнал) в электрический с помощью специальной аппаратуры. Для считывания и записи информации используют электронные системы усиления и регистрации сигнала. Существует большое разнообразие физических транс дьюсеров: электрохимические, спектроскопические, термические, пьезоэлектрические, различного рода оптические преобразователи, гравитационные, калориметрические, резонансные системы и т. п.

Все виды биоселектирующих элементов можно комбинировать с различными трансдьюсерами и тем самым создавать большое разнообразие различных типов биосенсоров.

Основными характеристиками, позволяющими биосенсорному анализу успешно конкурировать с традиционными методами, являются оперативность анализа, высокая специфичность и чувствительность при низкой стоимости, отсутствие необходимости использовать дорогостоящую аппаратуру.

Наличие в устройстве биоматериала с уникальными свойствами позволяет с высокой селективностью определять нужные соединения в сложной по составу смеси.

Разновидности биосенсоров и их применение. Разработка биосенсоров относится к наукоемким технологиям и представляет собой одну из ветвей современной биотехнологии. Существует несколько типов биосенсоров, среди которых наибольшее развитие получили ферментные и клеточные биосенсоры.

Ферментные биосенсоры могут быть представлены ферментными электродами, ферментными микрокалориметрическими датчиками, биодатчиками на основе хемии биолюминесценции.

Ферментные (или безреагентные) электроды — устройства основаны на применении электрохимического способа определения веществ, образующихся в ходе ферментативного превращения. Представляют собой электрод с нанесенным поверхностным слоем (каким-либо природным полимером), содержащим один или несколько иммобилизованных ферментов (иногда фермент может находиться в растворенном состоянии в приэлектродном слое, окруженном мембраной). В зависимости от типа взятого за основу электрода, устройства подразделяют на потенциометрические и амперометрические.

Ферментные микрокалориметрические датчики — устройства основаны на использовании теплового эффекта ферментативной реакции. Состоят из двух колонок (измерительной и контрольной), заполненных носителем с иммобилизованным ферментом и снаряженных термисторами. При пропускании через измерительную колонку анализируемого образца происходит химическая реакция, которая сопровождается регистрируемым тепловым эффектом. Данный тип датчиков интересен своей универсальностью.

Хеми- и биолюминесцентные датчики — регистрируют световое излучение с различной длиной волны, испускаемое продуктами ферментативной реакции, находящимися в возбужденном состоянии. Конструкция включает колонку с иммобилизованными на носителе ферментами (люциферазой, пероксидазой) и светоприемное устройство. Заложенный в систему этого типа датчиков аналитический метод характеризуется прежде всего крайне высокой чувствительностью, позволяя определять фемтомольные (Ю^-12 М) количества вещества.

Электроды, в которых применены иммобилизованные ферменты, во много раз долговечнее и позволяют провести несколько сот измерений, тогда как электроды, в которых используются естественные ферментные препараты, — только около 50.

В настоящее время наиболее распространен амперометрический биосенсор для определения сахара в крови (на основе иммобилизованной глюкозоксидазы). В качестве физического трансдьюсера в нем использован так называемый электрод Кларка. Исторически этот биосенсор является самым «древним».

Для контроля содержания пенициллина в питательной среде для выращивания бактерий используют пенициллиновый электрод — pH-датчик, покрытый иммобилизованным ферментом пенициллазой.

Биосенсоры, основанные на кислородном электроде как физическом трансдьюсере, позволяют определять разнообразные субстраты ферментов: лактаты, L-аминокислоты, салицилаты, оксалаты, пируваты, т. е. анионы соответствующих карбоновых кислот.

С помощью биосенсоров можно решать и обратную задачу: при некоторой определенной концентрации субстрата оценивать активность собственно фермента по величине измеряемого сигнала (потенциала, тока и т. д.). Из описания работы фермента следует, что измеряемый сигнал зависит не только от концентрации субстрата, но и от каталитической активности биологического преобразователя, т. е. фермента. Такое применение биосенсоров позволяет измерить активность большого числа ферментов, например, в крови. Оценка активности ферментов, связанных с сердечной деятельностью (таких, как аспартамаминотрансфераза, креатинкиназа), дает возможность в клинических условиях оценивать глубину инфаркта миокарда. Измерения активности фермента амилазы используют в педиатрии.

Клеточные биосенсоры. Одно из достижений биотехнологии связано с развитием методов включения живых клеток в полимеры и твердые носители различной природы и применением такого рода материалов для решения задач медицины и управляемого биосинтеза.

Методы иммобилизации клеток — физические и химические — сходны с методами иммобилизации отдельных ферментов. Стабильность иммобилизованных клеток определяется их метаболизмом, свойствами носителя и среды.

Наибольшее применение для иммобилизации нашли клетки микроорганизмов, которые легко культивируются, воспроизводятся и поддерживаются в чистой культуре, а также клетки растений, животных, человека. В отличие от ферментов, при их использовании не требуется дорогостоящих стадий очистки.

Имеющиеся методы позволяют получить клетки, сохраняющие около 100% активности ферментов и способные функционировать достаточно длительные промежутки времени (в некоторых случаях такие клетки сохраняют жизнеспособность и активность ферментных систем в течение нескольких лет). Клетки, как правило, сохраняют все системы жизнеобеспечения, что позволяет проводить сложные последовательные реакции, осуществляя многостадийные процессы.

Для многих типов клеток, особенно микробных, разработаны эффективные методы генетических трансформаций, позволяющие получать мутанты с высоким содержанием того или иного белка или фермента, что дает возможность оперировать с высокоэффективными каталитическими системами. Клетки сохраняют аппарат биосинтеза белка. На основе этого могут быть разработаны высокоэффективные методы генодиагностики.

Основные недостатки клеточных биосенсоров заключаются в медленном отклике электрода (что связано с необходимостью использовать толстые мембраны), а также в сравнительно низкой селективности, обусловленной присутствием в клетке или тканях нескольких ферментных систем. В процессе роста и размножения интактные клетки разрушают носитель, а дочерние клетки загрязняют получаемый продукт. Эта проблема решается торможением роста, что достигается созданием дефицита фитогормонов для иммобилизованных клеток растений либо добавлением антибиотиков при применении клеток бактерий.

Для создания биосенсоров используют различные микроорганизмы: Neigrospora europea — для определения аммиака, Trichosporon brassicae — для определения уксусной кислоты, Sarcinaflava — для определения глутамина, Azotobacter vinelaudit — для определения нитратов и др. На основе гриба Aspergillus niger группой японских ученых созданы биосенсоры для определения биогенных аминов в мясных продуктах. В тканевых электродах нашли применение срезы почек и печени свиньи, желтой тыквы, банана и др.

Первоначально для иммобилизации клеток с сохранением их активности применяли материалы природного происхождения: желатин, агар, альгинат кальция, каррагинан. В последние годы разработаны и развиты методы включения живых клеток в синтетические полимерные гели.

В пищевой, фармацевтической, текстильной, металлургической, химической и других отраслях промышленности используется большое количество разнообразных химических соединений: органических кислот и их солей, аминокислот, витаминов и т. д. Эти вещества можно синтезировать как химическим, так и биотехнологическим способом. Причем биотехнологический синтез предпочтительнее для пищевой и фармакологической промышленности, так как в этом случае продукты получаются более чистыми и дешевыми.

Иммобилизованные клетки нашли применение в различных отраслях народного хозяйства для синтеза разнообразных химических соединений биотехнологическим способом (табл. 4).

Таблица 4

Промышленное применение клеточных биосенсоров.

Биосенсоры можно использовать также для:

• — измерения пищевой ценности, свежести и безопасности продуктов питания;
• — экспресс-анализа крови непосредственно у кровати больного;
• — обнаружения и измерения степени загрязнения окружающей среды;
• — детекции и определения количества взрывчатых веществ, токсинов и возможного биологического оружия;
• — извлечения металлов из сточных вод;
• — изготовления водородных солнечных элементов;
• — очистки природных и сточных вод.

Распознавание определяемого вещества с помощью иммобилизованного биоматериала оказалось востребованным. Некоторые биосенсоры уже получают распространение для индивидуального применения в домашних аптечках (чаще всего для определения уровня сахара в крови). На очереди разработка конструкций биосенсоров, заменяющих рецепторы живых организмов, что позволит создать «искусственные органы» обоняния и вкуса, а также применять подобные разработки для возможно более точной и информативной диагностики ряда заболеваний.