Разработка трепонемного антигенного диаг-ностикума с коллоидным серебром для дот-иммуноанализа

В последние годы в иммунодиагностике четко просматриваются подходы, направленные на расширение круга маркеров, повышающих специфичность и чувствительность определения, сокращающих время анализа, обеспечивающих продолжительность сохранения свойств иммунодиагности-кумов и снижение себестоимости тест-систем (Коллинз У.П., 1991). Во многом эти задачи могут решаться подбором более эффективных меток, поскольку наиболее часто используемый ферментный маркер — пероксидаза хрена — имеет ряд недостатков, среди которых: относительно сложная процедура выделения и очистки функционально активного фермента и обусловленная этим значительная стоимость полученного маркера и, соответственно, — диагностикума на его основе; значительная (30−50%) потеря активности фермента и лиганда в процессе получения конъюгата путем ковалентного связывания этих реагентов (Кривеня В.Я., Елигулашвили Р. К., 1983); необходимость обеспечения в процессе анализа строгих физиологических условий для нормального функционирования фермента (Кривеня В.Я., Елигулашвили Р. К., 1983; Березин И. В., Угарова Н. Н. Киршенгольц Б.М., 1975). Отмеченные недостатки послужили основанием для развертывания работ по изысканию хромогенных маркеров для иммунохимических реакциий.

Поиски доступных, дешевых каталитически активных металлов, способных с высокой чувствительностью выявляться «физическим проявлением» обратили внимание на серебро. Имеющиеся единичные работы в доступной литературе свидительствуют, что золь каллоидного серебра обладает рядом положительных характеристик, позволяющих использовать его в качестве маркеров специфических иммунных реагентов в иммунохимическом анализе (Патент RU № 2 092 853, 1997; Загоскина Т. Ю., Марков Е. Ю., Кали-новский А.И., 2001; Загоскина Т. Ю., Калиновский А. И., Меринов С. П. и др.,.

2002; Полтавченко А. Г., Полтавченко Д. П., 2002; Полтавченко А. Г., Полтавченко Д. П., Загоскина Т. Ю., 2002; Загоскина Т. Ю., Голубинский Е. П., Меринов С. П., 2004).

Нами впервые разработана биотехнология изготовления серебросо-держащего антигенного трепонемного диагностикума для дотиммуноанализа (ДИА), которая включает следующие этапы: получение водной взвеси частиц маркера с заданной дисперсностью; конъюгирование маркера со специфическим к определяемому лиганду иммунореагентом; стабилизация конъюгатов и блокирование свободных сайтов связывания на поверхности частиц маркера высокомолекулярными биополимерами; коррекция водородного показателя водной взвеси иммунодиагностикума до параметров, необходимых для осуществления иммунохимической реакции (рисунок 17).

Получение высокодисперсной водной взвеси маркера может быть осуществлено восстановлением нитрата серебра цитратом или боргидридом (предпочтительнее) натрия. В процессе получения золей серебра мы учли рекомендацию М. И. Шалкаускаса, А. Ю. Вашкялиса (1977) и А. Г. Полтавченко с соавт. (1998) о том, что для восстановления азотнокислого серебра боргидридом натрия необходимо брать избыток последнего, поскольку только 20−30% боргидрида участвуют в восстановлении металла, остальной за время реакции подвергается гидролизу. Кроме того, избыток бор-гидрида гарантирует полное восстановление ионов серебра из раствора, что предотвращает на последующих этапах приготовления иммунозоля связывание с иммунореагентами и негативное влияние на их специфическую активность (Розовский Г. И., 1971). Как показал А. Г. Полтавченко с соавт. (1998, 2002), наиболее перспективным для использования в качестве маркера яв-ляя*ется золь, полученный из 0,02% водного раствора нитрата серебра (средний размер частиц около 9 нм). Он стабилен, содержит сферические частицы с поверхностью около 300 нм, способен обеспечивать высокую чувствительность выявления «физическими проявителями» со значительным диапазоном линейной зависимости оптической плотности от концентрации золя и сразу после приготовления имеет рН около 9,0, оптимальный для сорбции белкового лиганда.

Конъюгирование маркера со специфическим к определяемому лиган-ду иммунореагентом может быть осуществлено физической сорбцией или с использованием промежуточных связующих реагентов. Вследствие значительной площади поверхности частиц маркера (с поверхностью частиц золя серебра размером 1−2 мкм могут связываться сотни тысяч молекул типа IgG) могут быть использованы иммунореагенты с относительно невысокой специфической активностью, поскольку достаточный уровень активности иммунодиагностикума может быть достигнут адсорбцией на частице маркера от нескольких сотен до нескольких тысяч активных молекул специфического иммунореагента. Больший уровень специфической нагрузки не дает выигрыша в чувствительности анализа и, более того, в ряде случаев повышает неспецифический фон определения. При отработке процедуры конъю-гирования хорошие результаты получаются в процессе связывания маркера с иммунореагентом путем его дробного введения в смесь.

Важной характеристикой серебряных иммунозолей (золей, частицы которых сорбционно связаны с иммунореагентами) является их агрегативная устойчивость в процессе хранения и при проведении анализа. Агрегацию (коагуляцию) вызывают любые электролиты, но с заметной скоростью. Она начинается лишь при достижении определенной пороговой концентрациитак называемого «порога быстрой коагуляции».

В качестве стабилизаторов, предотвращающих агрегацию частиц и защищающих их от коагулирующего действия электролитов, используют высокомолекулярные природные или синтетические соединения и поверхностно активные вещества. Они связываются с поверхностью частиц посредством нековалентных связей, в основном, электростатической и гидрофобной природы, и образуют стабильные комплексы (Batteiger В., Newhall W.J., Jones R.B., 1982; Raska I., 1988).

Стабилизацию полученного конъюгата и блокирование свободных сайтов связывания на поверхности частиц маркера производят одним из известных высокомолекулярных соединений или их комбинацией.

Известно, что ионы серебра обладают бактериостатическим действием, основанным на образовании нерастворимых комплексов. Это приводит к изменению вторичной структуры белковой молекулы, что вызывает необратимую денатурацию белка. В реакцию вступают карбоксильные группы кислых — кислотных остатков: чем больше ионизированных карбоксильных групп на молекуле белка, тем активнее она денатурируется ионами серебра. С учетом вышеизложенного при работе с серебряными иммунозо-лями вытекают два практически важных следствия. Во-первых, поскольку в коллоидном растворе всегда присутствуют свободные ионы серебра, они могут денатурировать молекулы иммунореагента. Чтобы избежать этого, стабилизирующий раствор должен содержать более кислый белок. Во-вторых, надежды на бактериостатические свойства серебряного золя при хранении им-мунодиагностикума не всегда бывают оправданы, поскольку следовые количества ионов серебра, достаточные для инактивирования микроорганизмов в чистой воде, в иммунозоле расходуются на взаимодействие с кислыми белками стабилизирующего раствора. В связи с этим для длительного хранения необходимо вводить в состав диагностикума консервант, например, азид натрия.

Связывание белков с частицами золя тяжелых металлов в значительной степени является необратимым, однако следует учитывать, что разные участки поверхности коллоидных частиц металла обладают неодинаковой связующей способностью, а некоторые участки поверхности золей серебра вообще не связываются с белками (Джеймс Х., 1980; Raska I., 1988). Отсюда часто при выборе дозы иммунореагента исследователи ориентируются не на теоретические расчеты, а на эмпирически найденные значения.

Золи серебра мало контрастны и с увеличением размеров частиц от 5 до 100 нм изменяют окраску от светло-желтой до темно-бурой. Окраску, обусловленную непосредственно накоплением частиц золя, удается визуально обнаружить только при значительных скоплениях крупных частиц, дающих более интенсивный цвет на белых подложках. Высокодисперсные золи даже при их значительном накоплении на нитроцеллюлозной мембране (НЦМ) трудно визуально зарегистрировать, поэтому для учета результатов имму-ноанализа необходимо усиление сигнала.

Учитывая упомянутые выше методические приемы, мы провели ряд исследований по отработке биотехнологии изготовления трепонемного им-мунодиагностикума с частицами золя серебра.

Золь серебра получали восстановлением азотнокислого серебра бор-гидридом натрия. Для этого к 5 мл 0,05% водного раствора боргидрида натрия одномоментно приливали равный объем 0,02% водного раствора азотнокислого серебра. Перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 15 мин.

При конструировании диагностикума использовали комплексный тре-понемный антиген (глава 4).

Прежде чем комплексировать золь с лигандом, необходимо было определить количество последнего, способного стабилизировать золь, используя флокуляционный тест. Для расчета минимального количества антигена в 10 лунок планшета для РПГА вносят по 50 мкл дистиллированной воды и титруют в них (с шагом 2) белковую суспензию. Затем в каждую лунку добавляют по 250 мкл золя, перемешивают и через 5 мин вносят по 250 мкл 10% раствора натрия хлорида. Спустя 2−3 минуты визуально, по цвету золя, учитывают результат. Даже слабое отклонение цвета от соломенно-желтого свидетельствует о нестабильности комплекса. Для расчета оптимального количества препарата мы следовали рекомендациям I. Raska (1988). Например, в случае изменения цвета в 6-й лунке микропланшета при добавлении раствора хлорида натрия считаем, что это разбавление образца 1:32. При этом объем белковой суспензии 50 мкл/32 будет стабилизировать 250 мкл золя. Таким образом, для приготовления 10 мл диагностикума необходимо 50/32 х (10 000 мкл/250 мкл) = 62,5 мкл. Для большей надежности увеличиваем объем белка на 20%, добавляя таким образом в 10 мл золя 62,5 + 20% = 75 мкл белка. Для длительного хранения комплекса необходима его консервация азидом натрия.

Наиболее эффективно стабилизировал золь серебра антиген в количестве 375 мкг на 10 мл золя. Исходя из этого, для приготовления диагности-кума к 1 мл антигена (375 мкг белка) при постоянном интенсивном перемешивании добавляли 5 мл золя серебра. После 10-минутного перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре в раствор добавляли следующую порцию золя — 3 мл, а спустя 10 мин — еще 2 мл золя и 2 мл 10% водного раствора БСА (для блокирования свободных сайтов связывания на поверхности частиц маркера). Через 30 мин перемешивания диагностикум стабилизировали внесением равного объема 0,02 М фосфатного буфера рН 7,2, содержащего 1% БСА, 10% НЛС и 0,04% азида натрия. Приготовляемый препарат дополнительно интенсивно встряхивали в течение 30 минут, разливали в ампулы ШПВ-6 по 2 мл. Срок хранения диагностикума — 6 месяцев.

Подбор условий постановки и учет реакции Постановку реакции осуществляли традиционным для дот-иммуноанализа способом. Сыворотки крови перед исследованием инактиви-ровали при 56 ⁰С в течение 30 мин, разводили забуференным физиологическим раствором (ЗФР) рН 7,2 с 0,5% БСА в 200 раз и титровали путем двухкратного разведения до необходимой концентрации в планшете для иммунологических реакций. Каждое разведение сывороток наносили на твердофазный носитель в объеме 1 мкл в виде линейно расположенных точек. В качестве такового мы апробировали НЦМ для электрофореза «Bio-Rad», «Mil-lipor», «Serva» и мембранные фильтры «Amicon», «Millipor», «Sinpor» и «Владипор» с различным размером пор, исходя из того, что прочность связывания ими антител и их сорбционная емкость может быть неоднозначна.

Проведенные испытания показали, что наименее пригодными оказались мембранные фильтры «Amicon», «Millipor» и «Владипор». Хорошими характеристиками обладали НЦМ и мембранные фильтры «Sinpor» (достаточная сорбционная емкость и прочность связывания наносимого материала).

После нанесения исследуемого материала (1 мкл) на мембрану мы испытали несколько режимов иммобилизации: 20,30,40 мин при (20±1) ⁰С, 10,15,20 мин при 37 ⁰С. Для ускорения высыхания капли можно использовать вентилятор. Все режимы сорбции были приемлемы, для дальнейшей работы нами избран режим: 10 мин при 37 ⁰С.

Мембрану после фиксации материала помещали в чашку Петри и однократно промывали ЗФР. Затем подложку заливали ЗФР, содержащим 1% БСА, блокируя таким образом на ней свободные участки связывания в течение 10−15 мин при комнатной температуре. После двукратного промывания ЗФР мембрану помещали на 5−10 мин в раствор диагностикума, затем тщательно (трехкратно по 2−3 мин) промывали ЗФР и однократно — дистиллированной водой. Визуализацию результатов реакции проводили погружением мембраны в раствор проявителя на 5−8 мин.

При выполнении настоящей работы мы опробовали 14 составов проявителей для каталитического усиления сигнала серебряного золя.

Проявитель выбирали по проявляющему веществу: амидол, гидрохинон, глицин, метол, фенидон в разных сочетаниях (таблица 12).

Химические ингредиенты проявителей растворяли при температуре воды от 0 до 5 ⁰С (для проявителя № 6 воду брали с более низкой температурой -18−22 ⁰С, так как при растворении щелочи выделяется большое количество тепла).

При приготовлении раствора по рецепту нужно добавлять следующее по порядку вещество только после растворения предыдущего. При приготовлении проявителей сначала следует растворить сохраняющее вещество, затем проявляющее. Метол — исключение из этого правила, так как он труднее растворяется в растворе сульфита. В этом случае сначала растворяют в воде небольшое количество сульфита, затем метол, далее — основное количество сульфита, гидрохинон и дальнейшие составные части после того, как каждое предыдущее вещество растворилось.

Результаты испытаний показали, что проявители, содержащие метол, развивали высокую оптическую плотность: исследуемые сыворотки крови, содержащие специфические антитела, проявлялись в виде серо-коричневых пятен различной интенсивности в зависимости от количественного содержания антител. В то же время остальные проявители давали светлые малоконтрастные отложения (рисунок 18).

Картина проявления сохраняется и после небольшой передержки (более 7 мин) проявителя — диффузное серебро, восстановленное в растворе, легко отмывалось, тогда как восстановленное на сорбированных частицах золя на твердой матрице удерживалось прочно. В связи с этим в экспериментах мы использовали проявитель, содержащий метол.

Используя сконструированный иммунодиагностикум, исследовано в ДИА с коллоидным серебром 215 проб сывороток крови больных различными формами сифилиса, 55 — обследуемых на сифилис. Контрольной группой служили сыворотки крови 70 лиц, свободных от сифилитической инфекции. Эти же сыворотки параллельно оценивались в МР. Результаты испытаний, представленные в таблице 13 и рисунках 19, 20, несомненно свидетельствуют о высокой чувствительности разработанного диагностикума. Так, у 157 (73%) больных обнаруживались антитрепонемные Ат в титрах 1:400, у 58 (27%) человек — 1:800, в то же время как из 215 больных, обследованных в МР, лишь у 165 (77,3%) больных отмечен положительный результат. Из 55 обследуемых на сифилис у 40 (72%) титр сывороток в ДИА был равен 87.

Таблица 13. Сравнительное исследование сывороток крови.

1:400, у 5 (9%) — 1:800, и лишь у 10 (18,2%) — отрицательный результат. Реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном у 45,7% обследуемых (25 человек) была отрицательной. Специфичность иммунодиагности-кума на основе коллоидного серебра подтверждена при исследовании 70 сывороток крови лиц, свободных от сифилитической инфекции (Акт испытаний от 26.09.2004).

Таким образом, золь серебра является достаточно стандартным и легко воспроизводимым препаратом, пригодным для применения в качестве маркера иммунных реагентов. Нами впервые сконструирован высокочувствительный и высокоспецифичный иммунодиагностикум для ДИА с использованием комплексного трепонемного антигена, меченного частицами коллоидного серебра. Этот тест, в сравнении с традиционными серологическими реакциями на сифилис, более чувствителен, экспрессен, экономичен и свидетельствует о перспективности ДИА со специфическим антигеном трепонем, меченным коллоидным серебром, в качестве экспрессного ультрамик-рометода лабораторной диагностики сифилиса.