Исследование вирусов и антивирусных препаратов методами атомной силовой и просвечивающей электронной микроскопии

Диссертация посвящена изучению структурной организации вирусов и антивирусных препаратов методами атомной силовой (АСМ) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).

Сканирующий зондовый микроскоп, и, в частности, атомный силовой микроскоп представляет собой инструмент для получения изображений с большим динамическим диапазоном, выходящим за пределы возможностей оптических и электронных микроскопов. Он является также прибором для контурного изучения поверхности с беспрецедентным трехмерным разрешением. В некоторых случаях при помощи АСМ возможно проводить замеры таких физических величин, как проводимость поверхности образца, распределения статического заряда, локализованного трения и эластических модулей. Соответственно, сферы применения АСМ весьма разнообразны. В последние годы АСМ используют для изучения не только объектов с твердой кристаллической поверхностью, где пространственное разрешение может достигать тысячных долей нанометра в направлении по нормали к образцу и сотые доли нанометра в плоскости образца, но и для большого количества биологических объектов, таких как дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) и их комплексы с белками и поверхностно активными веществами, различных биополимеров, вирусных частиц и даже клеток. [1] По сравнению с ПЭМ — самым популярным на сегодняшний день методом изучения структурно-морфологических свойств биологических макромолекул, АСМ имеет ряд существенных преимуществ: а) АСМ позволяет получать уникальную информацию как о высоте исследуемого объекта (в ПЭМ этот параметр вычисляется лишь косвенными методами), так и о ряде его локальных поверхностных свойствб) АСМ, на сегодняшний день, единственный метод высокоразрешающей микроскопии, позволяющий исследовать биообъекты в их естественном водном окружении, близком к in vivoв) в.

ACM значительно упрощена процедура приготовления образцов и обработка полученной информации. Таким образом, сочетание двух методов: атомной силовой и просвечивающей электронной микроскопии существенно расширяет возможности при решении структурно-морфологических задач вирусологии.

Исследования, посвященные определению структурной организации вирусов, являются важными, прежде всего, в фундаментальном отношении, так как выявляют общие закономерности организации биологических структур на молекулярном уровне. Так, структура упакованной двухцепочечной ДНК внутри головки бактериофага уже многие годы представляет интерес для биологов, так как является прокариотическим аналогом организации ДНК в хромосоме.

До сегодняшнего дня все подходы для решения этой задачи, в конечном итоге, ограничивались возможностями электронной микроскопии, которая, теоретически, позволяет непосредственно визуализировать внутреннюю структуру капсида, но, на практике, условно применима, т.к. до сих пор не разработаны методы мягкой деструкции вирусного капсида, позволяющие разрушить белковую оболочку головки, при этом не повредив внутреннюю укладку ДНК.

Цель настоящего исследования заключалась в получении методами атомной силовой микроскопии принципиально новой информации о внутренней структуре фаговой головки. Исследования проводились на малоизвестном бактериофаге Phi КZ (Pseudomonas aeruginosa), который обладает очень редким строением капсида, а именно имеет внутренний белковый стержень, который, как предполагается, играет ключевую роль в упаковке геномной ДНК. В качестве тест объекта был использован хорошо изученный бактериофаг Т4 {Echerihia coli).

В рамках данной диссертации так же проводились исследования структуры и морфологии мультивалентных гликоконъюгатов, которые являются мощными ингибиторами вируса гриппа. В настоящее время ведутся широкомасштабные исследования механизмов клеточной адгезии (прикрепление вирусной частицы к мембране клетки-хозяина) различных вирусов, поиск их клеточных рецепторов, а также эффективных ингибиторов адгезии, позволяющих предотвратить инфицирование клетки, которые, в перспективе, могут использоваться для профилактики и лечения вирусных заболеваний. [2] Рецепторами для полиомавирусов, ротавирусов, ортои парамиксовирусов, вирусов иммунодефицита человека и некоторых других вирусов являются фрагменты углеводных цепей гликопротеинов и гликолипидов, находящихся в составе клеточных мембран [3].

Созданные в лаборатории Химии углеводов ИБХ РАН мультивалентные гликоконъюгаты являются эффективными ингибиторами клеточной адгезии вируса гриппа. Изучение с помощью АСМ строения, морфологии и антивирусных свойств синтезированных гликоконъюгатов позволит осуществить последовательную оптимизацию структуры мультивалентного ингибитора, ведущую к повышению его противовирусной активности.

II. Литературный обзор

II.1. Атомная силовая микроскопия (общие положения).

Принцип функционирования АСМ относительно прост. Микроскоп сканирует поверхность образца при помощи острой иглы, длина которой равна паре микрон, а диаметр часто ниже 100 ангстрем. Игла располагается на свободном конце треугольной микробалки (кантеливера), покрытой хорошо отражающим материалом (чаще — золотом). Длина кантеливера составляет от 100 до 200 микрон. Силы, возникающие между иглой и поверхностью образца, вызывают изгиб или отклонение кантеливера. Детектор измеряет степень отклонения кантеливера по смещению отраженного от его поверхности лазерного луча, по мере того, как игла проходит над образцом или по мере перемещения образца под иглой. На основании данных о отклонении кантеливера, компьютер может составить карту топографии поверхности (См. Рис. 1). [4] лазерный диод четырехсекциоиный фотодиод.

РИСУНОК 1. Схема атомного силового микроскопа.

ACM могут использоваться для изучения диэлектриков и полуповодников, также как и проводящих материалов. Отклонение кантеливера АСМ происходит, обычно, под влиянием нескольких сил. Сила, которая больше других ассоциируется с атомной силовой микроскопией, представляет собой межатомную силу, получившую название ван-дер-ваальсовой силы. [5] Зависимость ван-дер-ваальсовой силы от расстояния между иглой и образцом показана на Рис. 2 Два дистанционных режима отмечены на рисунке 1:1) контактный режим и 2) неконтактный режим.

РИСУНОК 2. Зависимость ван-дер-ваальсовой силы от расстояния между иглой и образцом.

В контактном режиме кантеливер поддерживается на расстоянии менее нескольких ангстремов от поверхности образца и межатомная сила, действующая между кантеливером и образцом является силой отталкивания. В неконтактном режиме кантеливер поддерживается на расстоянии порядка десятых или сотых долей ангстрема от поверхности образца и межатомная сила, действующая между кантеливером и образцом является силой притяжения (в основном, в результате дальних ван-дер-ваальсовых взаимодействий). [6].

II.2. Контактная атомная силовая микроскопия.

В режиме контактной АСМ, известном так же как отталкивающий режим, игла АСМ входит в мягкий «физический контакт» с образцом. Игла крепится к концу кантеливера, имеющего низкую пружинную жесткостьниже фактической пружинной константы силы, удерживающей атомы образца вместе. По мере того, как сканер плавно ведет иглу через образец (или образец под иглой), контактная сила вызывает изгиб кантеливера в соответствии с изменениями в топографии. Для получения более подробного представления об имеющих место явлениях следует обратиться к ван-дер-ваальсовой кривой на Рис. 2. [7].

С правой стороны кривой атомы отделены один от другого большими расстояниями. По мере того, как атомы постепенно приближаются один к другому, они первоначально слабо притягиваются. Эта сила притяжения возрастает до тех пор, пока атомы не окажутся настолько близко друг от друга, что их электронные облака не начнут отталкиваться под воздействием электростатических сил. Это электростатическое отталкивание постепенно ослабляет силу притяжения по мере того, как разделяющее атомы расстояние продолжает уменьшаться. Сила падает до нулевого значения в тот момент, когда расстояние между атомами достигает нескольких ангстремов, т. е. длины химической связи. В тот момент, когда величина ван-дер-ваальсовой силы станет положительной (отталкивающей), атомы входят в контакт. [8].

Наклон ван-дер-ваальсовой кривой очень крутой в отталкивающем или контактном режиме. В результате этого отталкивающая ван-дерваальсовая сила уравновешивает практически любую силу, пытающуюся прижать атомы ближе один к другому. В АСМ это означает, что при прижимании иглы к образцу, кантеливер скорее сгибается, чем прижимает атомы иглы к атомам образца. Даже если будет разработан очень жесткий кантеливер для того, чтобы воздействовать на образец значительными силами, межатомное расстояние между атомами иглы и образца вряд ли значительно сократится. Вместо этого может произойти деформация образца. [9].

Помимо описанной выше отталкивающей ван-дер-ваальсовой силы в процессе работы АСМ в контактном режиме обычно присутствуют и две другие силы: капиллярная сила, вызываемая тонким слоем воды, который практически всегда образуется из-за ненулевой влажности окружающей среды, и сила, производимая самим кантеливером. Капиллярная сила возникает тогда, когда вода окружает иглу, создавая значительную силу притяжения (около 10″ 8 Н), которая удерживает иглу в контакте с поверхностью. Величина капиллярной силы зависит от расстояния между иглой и образцом.

Сила, производимая кантеливером, напоминает усилие сжатой пружины. Величина и направление действия (отталкивающее или притягивающее) силы кантеливера зависят от степени отклонения кантеливера и от его пружинной жесткости. [10].

Пока игла находится в контакте с образцом, величина капиллярной силы должна быть постоянной, так как расстояние между иглой и образцом, практически, не изменяется. Кроме того, предполагается, что водный слой достаточно однороден. Сила, производимая кантеливером в контактной АСМ, напротив, все время меняется. Результирующая сила, которую игла производит на образец, представляет собой сумму капиллярных и кантеливерных сил. Она должна уравновешиваться в контактной АСМ отталкивающей ван-дер-ваальсовой силой. Величина результирующей силы, производимой на образец, колеблется от Ю-8 Н (когда кантеливер отводится от образца примерно с той же силой, с какой вода тянет иглу вниз) до более типичного рабочего диапазона — от.

10 Н до 10″ 6 Н [11].

Большинство АСМ, имеющихся в настоящее время на рынке, определяет отклонение кантеливера при помощи оптических методов. По наиболее часто встречающейся схеме, показанной на Рис. 1, лазерный луч отражается от задней части кантеливера, попадая в позиционно-чувствительный фотодетектор (ПЧФ). При сгибании кантеливера положение лазерного луча на задней части кантеливера смещается. ПЧФ сам по себе может измерять смещения светового луча величиной всего 10 ангстрем. Соотношение длин оптических путей лазерного луча от лазера до кантеливера и от кантеливера до фотодетектора дает коэффициент усиления. В результате этого, система может обнаруживать вертикальное смещение иглы кантеливера величиной менее ангстрема. В других методах определения отклонения кантеливера используется оптическая интерференция или даже игла сканирующего туннельного микроскопа для считывания отклонения кантеливера. Одна из весьма изящных методик заключается в изготовлении кантеливера из пьезорезистивного материала с тем, чтобы его отклонение могло обнаруживаться электрическим способом [12]. (В пьезорезистивных материалах напряжение, связанное с механической деформацией, вызывает изменение в удельном сопротивлении материала.) Для пьезорезистивной детекции лазерный луч и ПЧФ не требуются.

После того, как АСМ обнаружил отклонение кантеливера, он может создавать набор топографических данных, работая в одном из двух режимов: постоянной высоты или постоянной силы [8].

В режиме постоянной высоты пространственное изменение отклонения кантеливера может непосредственно использоваться для создания набора топографических данных, так как высота сканера в процессе сканирования — фиксирована.

В режиме постоянной силы отклонение кантеливера может использоваться в качестве входных данных для контура обратной связи, который перемещает сканер вверх и вниз по оси Z в зависимости от топографии, сохраняя при этом отклонение кантеливера постоянным. В этом случае изображение формируется, исходя из перемещения сканера. При поддержании отклонения кантеливера постоянным, результирующая сила, прилагаемая к образцу, остается постоянной.

В режиме постоянной силы скорость сканирования ограничивается временем реагирования контура обратной связи, но результирующая сила, прилагаемая к образцу иглой хорошо контролируется. Режим постоянной высоты необходим для записи в реальном времени изображений изменяющихся поверхностей, когда важно иметь высокую скорость сканирования [1,5].

II.3. Неконтактная атомная силовая микроскопия.

Неконтактная ACM (НАСМ) представляет собой одну из нескольких методик, предусматривающую применение вибрирующего вблизи поверхности образца кантеливера. Расстояние между иглой и образцом в НАСМ порядка нескольких нанометров. Это расстояние отмечено на ван-дер-ваальсовой кривой на Рис. 2 как неконтактный режим [11].

Использование НАСМ желательно, так как она дает возможность измерения топографии образца при незначительном контакте между иглой и образцом или при полном его отсутствии. Как и контактная АСМ, неконтактная АСМ может использоваться для измерения топографии диэлектриков и полупроводников, а так же проводников. Результирующая сила между иглой и образцом в неконтактном режиме весьма низкая, обычно около Ю" 10 Н. Наличие такой низкой силы имеет преимущества для изучения мягких или эластичных образцов [13].

Так как сила, возникающая между иглой и образцом в неконтактном режиме, — слабая, измерить ее труднее, чем силу, имеющуюся в контактном режиме, которая может быть на несколько порядков выше. Кроме того, кантеливеры, используемые для неконтактной АСМ, должны быть более жесткими, чем те, которые используются для контактной АСМ, так как мягкие кантеливеры могут быть втянуты в контакт с поверхностью образца. Малые значения силы для неконтактного режима и более высокая жесткость кантеливеров, используемых для неконтактной АСМ, являются факторами, ведущими к тому, что сигнал в неконтактной АСМ слабый, и, соответственно, его измерение затруднено. По этой причине для работы в режиме неконтактной АСМ используется чувствительная схема детекции. В неконтактном режиме система вызывает вибрацию жесткого кантеливера на частоте, близкой к его резонансной частоте (обычно от 100 до 400 кГц) с амплитудой колебаний от нескольких десятков до нескольких сот ангстремов. Затем она определяет изменения в резонансной частоте или амплитуде вибрации по мере того, как игла приближается к поверхности образца. Чувствительность такой схемы детекции дает на изображении вертикальное разрешение порядка ниже ангстрема, как в контактной АСМ [14].

Соотношение между резонансной частотой кантеливера и изменениями в топографии образца можно объяснить следующим образом. Резонансная частота кантеливера изменяется как квадратный корень из его пружинной жесткости. Кроме того, пружинная жесткость изменяется по мере изменения градиента силы, прилагаемой к кантеливеру. И, наконец, градиент силы, представляющий собой производную кривой зависимости от расстояния, показанную на Рисунке 1, изменяется при изменении расстояния между иглой и образцом. Таким образом, изменения в резонансной частоте кантеливера могут использоваться в качестве средства измерения градиента силы, отражающего изменения в расстоянии между иглой и образцом или топографию образца [15].

В режиме неконтактной АСМ система следит за резонансной частотой или амплитудой вибрации кантеливера и поддерживает ее постоянной при помощи системы обратной связи, которая перемещает сканер вверх и вниз. За счет сохранения постоянного значения резонансной частоты или амплитуды система также поддерживает постоянным среднее значение расстояния от иглы до образца. Как и контактная АСМ (в режиме постоянной силы) набор данных создается исходя из перемещения сканера. Для неконтактной АСМ не свойственно разрушение, которое иногда имеет место после снятия нескольких сканов с использованием контактной АСМ. Как говорилось выше, неконтактная АСМ предпочтительнее контактной АСМ при проведении измерений на мягких образцах. В случае использования твердых образцов изображения, полученные в контактной и неконтактной модах, могут выглядеть одинаково. Однако если на поверхности твердого образца присутствуют, например, несколько мономолекулярных слоев конденсированной воды, изображения могут сильно различаться. АСМ, работающий в контактном режиме, будет обеспечивать прохождение сквозь слой жидкости для получения изображения находящейся под ним поверхности, тогда как в неконтактном режиме АСМ выдаст изображение жидкого слоя (См. Рис. 3).

14] изображение в контактной изображениеш баэконтактаой ССМ мода.

РИСУНОК 3. Изображение поверхности с каплей воды, сделанные в режиме контактной и неконтактной АСМ.

В тех случаях, когда образец с низкими модулями упругости может быть поврежден проведением иглы АСМ по его поверхности, может быть применен другой режим работы АСМ: прерывисто контактный режим. Прерывисто контактный режим удобен для целого ряда вариантов практического применения [6].

II.4. Прерывисто-контактная атомная силовая микроскопия.

Прерывисто контактная атомная силовая микроскопия (ПКАСМ) аналогична НАСМ с той разницей, что в ПКАСМ вибрирующий кантеливер подводится к образцу ближе, так что в конечной точке его перемещения едва касается или «дотрагивается» до образца. Участок работы ПКАСМ показан на ван-дер-ваальсовой кривой на Рисунке 1. Как и в НАСМ, в ПКАСМ амплитуда колебаний кантеливера меняется в зависимости от расстояния между иглой и образцом. Изображение, представляющее топографию поверхности, получается за счет отслеживания этих изменений [16].

Некоторые образцы оптимально исследуются при применении ПКАСМ вместо контактной или неконтактной АСМ. При использовании ПКАСМ более низка вероятность повреждения образца, чем при использовании контактной АСМ, так как ПКАСМ устраняет поперечные силы (трение или торможение) между иглой и образцом. В целом, было установлено, что ПКАСМ более эффективна, чем НАСМ при создании изображения с более крупных сканов, которые могут включать более значительные изменения в топографии образца. ПКАСМ стала важным методом атомной силовой микроскопии, так как она позволяет преодолеть некоторые ограничения как контактной, так и неконтактной АСМ [17].

II.5. Кривые зависимости силы от расстояния.

Кривые зависимости силы от расстояния используются для измерения вертикальной силы, с которой игла воздействует на поверхность в процессе получения изображения в режиме контактной АСМ. Этот метод может также использоваться для анализа вязкости поверхностных загрязнений, толщины смазочного слоя и локальных изменений в эластических свойствах поверхности.

Точнее говоря, кривая зависимости силы от расстояния представляет собой графическое отображение отклонения кантеливера в зависимости от выдвижения пьезоэлектрического сканера, измеренного при помощи позиционно-чувствительного фотодетектора. Кривая ван-дер-ваальсовой силы на Рис. 1 представляет собой лишь один из факторов, влияющих на отклонение кантеливера. Локальные вариации формы кривой зависимости силы от расстояния свидетельствует о локальных изменениях эластических свойств. Наличие загрязнений и смазочных веществ влияет на результаты измерений, такой же эффект имеет и тонкий слой воды, который часто присутствует при использовании АСМ в воздушной среде [18].

В лабораторных условиях получаемые кривые зависимости силы от расстояния весьма сложны и определяются той или иной изучаемой системой. Данное описание относится к Рис. 4 и представляет собой сильное упрощение, в котором формы, размеры и расстояния не должны восприниматься буквально. Сим.

Wks*s.

45=;

I//! djr/с ЩшШ^щ.

РИСУНОК 4. Кривые зависимости сил от расстояния в вакууме (а), в воздухе (б), и в воздухе с загрязняющим слоем ©.

Имея это ввиду, рассмотрим простейший случай АСМ в вакууме (Рис. 4(a)).

В левой части кривой сканер полностью задвинут и кантеливер не отклоняется, так как игла не касается образца. По мере выдвижения сканера кантеливер продолжает оставаться не отклоненным до тех пор, пока он не приблизится на достаточное расстояние к поверхности образца, чтобы испытать воздействие ван-дер-ваальсовой силы притяжения. Игла входит в контакт с поверхностью (точка на Рис. 4(a)). Аналогичным образом, кантеливер вдруг слегка изгибается в направлении поверхности.

По мере того, как сканер продолжает выдвигаться, кантеливер отклоняется дальше от поверхности. Это отклонение почти линейное (зона б на Рис.

4(a)). После полного выдвижения в крайне правой части графика сканер

16 начинает задвигаться. Отклонение кантеливера описывает ту же кривую по мере того, как сканер отводит иглу от поверхности.

В воздушной среде кривая отвода в исходном положении часто отличается, так как на многих поверхностях присутствует мономолекулярный слой или несколько мономолекулярных слоев воды (Рис. 4(6)). Этот слой воды вызывает воздействие весьма значительной притягивающей капиллярной силы. При отводе сканера от поверхности вода удерживает иглу в контакте с поверхностью (зона в на Рис. 4(6), в центре). В определенной точке, в зависимости от толщины водного слоя, сканер отходит на достаточное расстояние для того, чтобы игла «оторвалась» от поверхности (точка d на Рис. 4(6), в центре). Эта точка известна как точка возврата. По мере того, как сканер продолжает отходить дальше после прохождения точки возврата, кантеливер остается без отклонения при перемещении его сканером от поверхности в свободном пространстве.

В случае присутствия смазочного слоя вместе со слоем воды, возможно наличие нескольких точек возврата, как это показано на Рис. 4(в). Положения и амплитуды точек возврата зависят от вязкости и толщины слоев, имеющихся на поверхности.

Контактная АСМ может использоваться в любой точке вдоль линейной части кривых зависимости силы от расстояния, в зонах (Ь) и ©. Работать в зоне © следует с мягкими образцами, для сведения до минимума результирующей силы между иглой и образцом. Работа с кантеливером, прогнутым в направлении поверхности, существенно менее стабильна и максимальные скорости сканирования должны быть снижены. Следует иметь в виду, что работа в зоне точек возврата также относится к контактному режиму, поскольку игла касается образца. Неконтактная АСМ используется непосредственно слева от точки (а) на кривой зависимости силы от расстояния, как раз перед тем как игла входит в контакт с поверхностью.

На линейном участке кривых зависимости силы от расстояния (Ь) наклон связан с модулем упругости системы. В тех случаях, когда кантеливер намного мягче поверхности образца, как это бывает при неразрушающем получении изображений, наклон кривой в основном отражает пружинную жесткость кантеливера. Однако, когда жесткость кантеливера намного выше жесткости поверхности образца, наклон кривой зависимости силы от расстояния дает возможность изучения упругих свойств поверхности [6].

II.6. Форма иглы кантеливера и разрешение.

Кантеливеры и их иглы являются важнейшими компонентами системы атомного силового микроскопа, так как они определяют силу, прилагаемую к образцу и окончательное горизонтальное разрешение системы.

Кантеливеры со встроенными иглами могут быть изготовлены из кремния или нитрида кремния с помощью фотолитографических методов. Из одной пластины кремния можно изготовить более 1000 кантеливеров со встроенными иглами. Наиболее популярны V-образные кантеливеры, которые обеспечивают низкое механическое сопротивление вертикальному отклонению и высокое сопротивление боковому скручиванию. Кантеливеры обычно имеют от 100 до 200 микрон в длину, от 10 до 40 микрон в ширину и от 0,3 до 2 микрон в толщину (см. Рис. 5) [19].

РИСУНОК 5. Кантеливер Vобразной формы с указанием Iдлины, wтолщины, t высоты.

Для атомных силовых микроскопов требуются не только острые иглы, но также и кантеливеры с оптимальными значениями пружинной жесткости — ниже пружинной константы между атомами твердого тела, которая имеет значение порядка 10Н/м. Пружинная жесткость кантеливера зависит от его формы, размеров и материала, из которого он изготовлен. Утолщенные и короткие кантеливеры, как правило, имеют большую жесткость и отличаются более высокими резонансными частотами. Значения пружинной жесткости кантеливеров, имеющихся в продаже, находятся в пределах четырех порядков величин: от тысячных долей ньютона на метр до десятых долей ньютона на метр. Резонансная частота у них бывает от нескольких килогерц до нескольких сотен килогерц, что обеспечивает высокую скорость срабатывания и дает возможность работы в режиме неконтактной АСМ.

Горизонтальное разрешение изображения, полученного на АСМ, определяется двумя факторами: размером шага изображения и минимальным радиусом иглы. Рассмотрим полученное изображение — 512 точек данных на 512. Такой скан размером один микрон на один микрон будет иметь размер шага — и горизонтальное разрешение (1 микрон=512) около 20 ангстрем.

Наиболее острые иглы, на сегодняшний день, могут иметь радиус до 10 нанометров. Поскольку зона взаимодействия между иглой и образцом представляет собой часть радиуса иглы, такие иглы, обычно, обеспечивают горизонтальное разрешение от 5 до 10 нанометров. Таким образом, разрешение, полученных на АСМ изображений более чем 1 микрон на 1 микрон, как правило, зависит не от размера иглы, а от размера шага изображения. Максимальное объявленное разрешение АСМ зависит, однако, от того, каким образом определять разрешение [15].

Среди специалистов по микроскопии бытует мнение о том, что два выступа (пика) считаются различимыми на изображении, если изображение удовлетворяет критерию Релея. В данном случае по критерию Релея требуется, чтобы высота изображенной поверхности опускалась, как минимум, на 19% между выступами, как показано на Рис. 6. минимальной расстояние между разрешаемыми объектами.

РИСУНОК 6. Определение горизонтального разрешения при помощи критерия Релея.

Для определения горизонтального разрешения СЗМ экспериментальным образом, выступы подводятся все ближе один к другому до тех пор, пока высота изображенной поверхности не перестанет опускаться между выступами на 19%. Минимальное расстояние между различимыми выступами определяет максимальное горизонтальное разрешение системы. При таком определении горизонтальное разрешение АСМ, оснащенных максимальными острыми иглами, имеющимися на сегодняшний день, от 5 до 10 нанометров [20].

На первый взгляд, разрешение 5−10 нанометров плохо сочетается с изображениями атомных решеток, повсеместно встречающимися в литературе, посвященной АСМ. Необходимо дать некоторые разъяснения относительно разницы между понятиями получения изображений элементов атомарного масштаба с точными интервалами и симметрией атомарной решетки и реальным атомарным разрешением.

В АСМ каждый атом иглы, участвующий в получении изображения (каждый затененный атом на Рис. 7) «видит» образец в форме периодической решетки.

РИСУНОК 7. Межатомное взаимодействие в АСМ. Затенение показывает силу взаимодействия.

Но поскольку атомы иглы находятся в различных горизонтальных положениях, решетка, которую видит каждый атом, смещена по отношению к решетке, которую видят его соседи, как показано на Рис. 8. оЯоЯоЯсЙЭ в vjVw — 7.

8 ¦ 9'.

10 '.

Sum:WWVWWV.

РИСУНОК 8. Скан периодической решетки в атомарном масштабе, выполненный на АСМ, показывающий суммарный результат данных, поступающий от каждого атома на каждый момент времени.

Каждый атом в игле также расположен на различной высоте относительно образца. Сила сигнала, который воспринимается каждым атомом в игле, ослабляется с увеличением расстояния до образца. Когда данные, поступающие от всех участвующих в процессе атомов иглы, включаются в каждый снимок, выполняемый в тот или иной момент времени, а результат суммируется по мере продвижения иглы по поверхности с периодической структурой, окончательное изображение отражает периодическую структуру и имеет правильную симметрию и интервалы. Однако, если один из атомов отсутствует, «дырка», оставшаяся на его месте не будет обнаружена, так как изображение представляет собой наложение многих изображений (см. Рис. 8). Для реального атомарного разрешения необходимо иметь возможность обнаружения даже одного отсутствующего атома. Соответственно, получение в атомарном масштабе изображения периодической решетки, что само по себе возможно при использовании контактной АСМ, не означает, что было обеспечено реальное атомарное разрешение.

Для получения изображений, как в контактном, так и в неконтактном режимах необходимо подбирать иглу с острием, размеры которого ниже самых малых элементов образца. Если острие иглы больше элементов поверхности, возникает искажение, известное как изображение при наличии интерференции от иглы. В этом случае каждая точка данных на изображении представляет собой пространственную свертку (в общем смысле, а не в смысле анализа Фурье) формы иглы и формы снимаемого объекта. Если острие иглы меньше объекта, на изображении отображается профиль края объекта. Однако, если объект меньше острия иглы, в изображении будет доминировать форма иглы. На Рис. 9 показано происхождение игловой свертки [21]. истинное изображение.

— траектория иглы изображение иглы траектория иглы.

РИСУНОК 9. Сравнение реального изображения с изображением при наличии интерференции от иглы.

II.7. Устройство и работа пьезоэлектрического сканера.

Практически во всех сканирующих зондовых микроскопах используется пьезоэлектрический сканер, представляющий собой чрезвычайно точную платформу позиционирования для перемещения зонда над образцом (или образец под зондом). Электронные схемы СЗМ управляют движением сканера по своего рода растру, как это показано на Рис. 10. i.: i • • ¦ • i. «—» < i 1: ' «• 1 > > ««-i .» ¦"-.-«—4 шаг скшшромння.

РИСУНОК 10. Движение сканера в процессе получения данных.

Сканер перемещается через первую строку скана и назад. Затем он делает шаговое движение в перпендикулярном направлении ко второй строке скана, перемещается через нее и назад, затем к третьей строке и так далее. Путь отличается от традиционного растра тем, что чередующиеся строки данных не снимаются в противоположных направлениях. Данные АСМ собираются только в одном направлении быстрого сканирования, для сведения до минимума ошибки построчного совмещения, вызываемые запаздыванием сканера. Перпендикулярное направление, в котором сканер совершает шаговое движение от линии к линии, называется направлением медленного сканирования.

В то время, пока сканер перемещается через строку скана, данные изображения отбираются цифровым способом через пространственно равные интервалы. Данные представляют собой высоту сканера по оси z для режима постоянной силы. Для режима постоянной высоты данные представляют собой отклонение кантеливера [22].

Расстояние между точками данных называется размером шага. Размер шага определяется размером полного скана и количеством точек данных в строке. В типичном АСМ размеры скана находятся в пределах от нескольких десятков ангстрем до более 100 микрон и от 64 до 512 точек данных в строке. (В некоторых системах предлагается 1024 точки данных в строке). Количество строк в наборе данных обычно равно количеству точек в строке. Соответственно, идеальный набор состоит из плотной, квадратной сетки измерений.

К пьезоэлектрическим материалам относится керамика, которая меняет размеры под воздействием прилагаемого напряжения. С другой стороны они накапливают электрический потенциал под воздействием механического давления. Пьезоэлектрические сканеры могут быть разработаны для перемещения по осям х, у, z с расширением в одних направлениях и сжатием в других. Пьезоэлектрические сканеры для АСМ обычно изготовляются из свинцово-циркониевого титаната или PZT, с добавлением различных легирующих добавок для получения особых свойств материалов. Сканеры изготовляются путем прессования порошка с последующим спеканием материала. В результате получается твердый поликристаллин. Каждый из кристаллов в пьезоэлектрическом материале имеет свой собственный дипольный момент. На этих дипольных моментах основывается способность сканера перемещаться под воздействием прилагаемого напряжения [22].

После спекания электрические дипольные моменты внутри сканера ориентированы произвольно. Если дипольные моменты не ориентированы соответствующим образом, сканер практически лишен возможности перемещаться. Процесс, называемый поляризацией, используется для ориентации дипольных моментов. В ходе поляризации сканеры нагреваются до температуры около 200 С для освобождения диполей и на сканер подается постоянный ток. В течение нескольких часов диполи ориентируются. В этот момент сканер охлаждается для замораживания диполей в ориентированном состоянии. Вновь поляризованный сканер может теперь реагировать на подаваемые на него напряжения, выдвигаясь и сжимаясь.

Периодическое использование сканера помогает сохранить поляризацию сканера. Напряжение, подаваемое для приведения сканера в движение, вновь вызывает ориентацию рассеянных диполей, которые переходят в произвольную ориентацию. Если сканер не поляризуется повторно за счет регулярного использования, значительная часть диполей начнет вновь разупорядочиваться (деполяризоваться) в течение нескольких недель. Деполяризация значительно усиливается, если сканер подвергается температурам свыше 150 С.

На многих АСМ используются различные варианты простой конструкции трубки, показанной на Рис. 11 [23].

В данной конструкции сканер имеет полую трубку. Электроды крепятся к внешней части трубки, деля ее электрически на вертикально расположенные четверти для перемещения по осям +х, +у, -х, иу. К центру трубки так же крепится электрод для обеспечения движения в направлении z. При подаче, например, на электроды +х их переменного напряжения, вызванное этим механическое напряжение трубки ведет к ее изгибу по оси х в том и другом направлении. Напряжение, подаваемое на электрод z ведет к выдвижению или возврату сканера в вертикальном направлении.

В большинстве случаев напряжение, подаваемое на электрод z сканера, в каждой точке измерения составляет набор данных АСМ (постоянной силы) или СТМ (с постоянным значением тока). В некоторых случаях используется внешний датчик для непосредственного измерения высоты расположения сканера.

Максимальный размер скана, который может быть получен при помощи какого либо конкретного пьезоэлектрического сканера, зависит от длины трубки сканера, диаметра трубки, толщины ее стенок и относительного удлинения керамического материала, из которого она была изготовлена. Обычно, в АСМ используются сканеры, которые могут осуществлять горизонтальное сканирование в пределах нескольких десятков ангстрем до более 100 микрон. В вертикальном направлении сканеры СЗМ могут различать изменения высоты от величины ниже ангстрема до около 10 микрон.

Пьезоэлектрические сканеры являются важнейшим элементом АСМ, ценность которых связана с разрешением ниже ангстремного уровня, компактными размерами и высокой скоростью реагирования [24]. Однако эти основные свойства сопровождаются и известными трудностями.

II.8. Артефакты в АСМ изображениях, появляющиеся вследствие собственной нелинейности сканера.

Весьма упрощенно можно сказать, что степень удлинения пьезоэлектрического сканера изменяется линейно вместе с подаваемым напряжением. (Удлинением называется изменение длины, деленное на первоначальную длину — Д1/1.). Следующее уравнение показывает идеальное соотношение между удлинением и прилагаемым электрическим полем:

S=dE где s — удлинение в А/м, Е — электрическое поле в В/м, a dкоэффициент удлинения в А/В. Коэффициент удлинения является характеристикой конкретного пьезоэлектрического материала.

На практике поведение пьезоэлектрических сканеров не такое простое — соотношение между удлинением и электрическим полем отличается от идеальной линейной характеристики.

Предположим, что подаваемое напряжение начинается с нулевого значения и постепенно повышается до определенной конечной величины. Если удлинение пьезоэлектрического материала представить графически в виде зависимости от подаваемого напряжения, график будет представлять собой не прямую линию, а кривую в форме буквы s, как показано на Рис. 12. Пунктирная линия на графике является линейным приближением к данным.

Собственная нелинейность пьезоэлектрического материала является соотношением между максимальным отклонением от линейной характеристики Ау и идеальным линейным удлинением у при данном напряжении. Другими словами — это нелинейность Ау/у, выраженная в процентах. Собственная нелинейность в пьезоэлектрических материалах, используемых в АСМ, обычно, находится в пределах от 2% до 25%.

В плоскости поверхности образца собственная нелинейность сканера выражается в искажении измерительной сетки, показанной на Рисунке 10. В связи с тем, что сканер не перемещается немедленно при подаче напряжения, точки измерения не располагаются на одинаковом расстоянии. Вследствие этого полученное на СЗМ изображение поверхности с периодическими структурами будет содержать неоднородные расстояния и изгиб линейных структур. Менее регулярные поверхности могут не содержать видимых искажений, даже если искажения присутствуют.

Перпендикулярно плоскости поверхности образца (в направлении z) собственная нелинейность вызывает ошибки при измерении высоты. Калибровка по высоте для АСМ обычно производится путем сканирования образца, имеющего известную шаговую высоту. На основе значения напряжения, подаваемого на электрод z при пересечении им шага возможен расчет z составляющей коэффициента. Однако, если этот коэффициент удлинения непосредственно применяется при измерении какого-либо элемента, отличающегося по высоте от калиброванной высоты, собственная нелинейность сканера будет вести к возникновению ошибки [25].

II.9. Метод атомной силовой микроскопии в приложении к биологическим объектам. Нуклеиновые кислоты.

Среди множества биологических объектов, к исследованию которых применялись методы зондовой микроскопии, первой была молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Однако на начальном этапе этих исследований отмечались сложности в интерпретации получаемых изображений. Так, авторы работ [26] представили данные сканирующей туннельной микроскопии (СТМ) по изучению молекул ДНК, адсорбированных на подложку из высоко ориентированного пиролитического графита (пирографита). Выбор данного материала в качестве подложки был обусловлен его проводящими свойствами, а также простотой приготовления атомарно гладких участков поверхности значительной площади. На СТМ-изображениях наблюдались протяженные цепочки, обладающие продольной периодичностью (период около 2−3 нм), на основании чего авторы делали вывод о визуализации витков двойной спирали.

Однако позднее были опубликованы данные [27], свидетельствующие о возможности наблюдения сходных «ДНК-подобных» структур при исследовании методом СТМ чистой, свежесколотой поверхности пирографита. Возникновение таких структур объясняется чувствительностью СТМ к электронным свойствам поверхности — происходит визуализация доменных стенок пирографита.

28]. Эти результаты, а также слабая воспроизводимость и отсутствие безусловно необходимых контрольных экспериментов в первых работах по СТМ — визуализации ДНК вызвали сомнения в применимости методов зондовой микроскопии для исследования макромолекул, адсорбированных на поверхности пирографита.

Существенное изменение ситуации произошло в 1992 году, когда были опубликованы первые надежные, стабильные и воспроизводимые результаты исследования ДНК методом атомной-силовой микроскопии.

29]. Эти результаты убедительно продемонстрировали уникальные возможности применения методов зондовой микроскопии к исследованию биологических объектов при условии использования адекватной методики приготовления образцов для иммобилизации исследуемых структур на подложке.

Универсальных методик приготовления образцов для решения широкого спектра задач зондовой микроскопии пока не существует, поэтому в каждом конкретном случае специфика задачи требует экспериментального определения адекватной процедуры иммобилизации исследуемых структур на подложке. При этом в большинстве случаев бывает необходимо, чтобы молекулы нуклеиновых кислот адсорбировались на подложку в развернутом состоянии. В настоящее время для анализа свойств данных макромолекул методом зондовой микроскопии апробирован целый ряд различных подходов к приготовлению образцов. Ниже приведены основные из них.

Первые надежные результаты исследования ДНК методом атомно-силовой микроскопии были получены в том случае, когда изучаемые структуры наносили из капли рабочего раствора (раствора буфера, водно-спиртовой среды и т. д.) на поверхность слюды, модифицированной ионами металлов Mg2+, Zn2+, Со2+, La3+, Zr4+ и т. д. [30] Эти ионы, по-видимому, служат связующими мостиками между отрицательно заряженной слюдой и отрицательно заряженными фосфатными группами молекулы ДНК (при нейтральном рН рабочих растворов). Модификация слюды может предшествовать процессу адсорбции макромолекул — в этом случае свежесколотую слюду помещают для предварительной обработки на некоторое время (минуты, часы) в раствор, содержащий катионы металлов, затем ее промывают дистиллированной водой и высушивают. После этого на модифицированную поверхность слюды наносят рабочий раствор с исследуемыми структурами. Другой подход — добавление солей металлов непосредственно к рабочему раствору — что позволяет исключить этап предварительной обработки слюды (образцы наносят непосредственно на свежесколотую поверхность слюды). В этом случае процессы адсорбции макромолекул и формирования ионных мостиков протекают коррелированно. После высыхания капли рабочего раствора образцы, как правило, подвергают дополнительной промывке (в дистиллированной воде или в водно-спиртовой среде) для уменьшения поверхностной концентрации примесей.

В работе [31] методом АСМ проводили сравнительный анализ процесса адсорбции макромолекул ДНК на слюду, как с использованием стабилизирующих катионов металлов, так и без них. Было показано, что во втором случае адсорбционные молекулы нестабильны в процессе предварительной промывки образцов и при сканировании. Кроме того, макромолекулы характеризуются большим количеством запутанных и перекрученных участков, тогда как при использовании связующих ионов и применении предшествующей сканированию промывки образцов молекулы ДНК адсорбируюся на поверхность подложки в расправленном состоянии.

Авторы работы [32] исследовали методом АСМ в жидкой ячейке обратимое осаждение молекул ДНК при различных параметрах исходного раствора в реальном масштабе времени. Было показано, что адсорбция макромолекул ДНК на поверхность подложки (слюды) и величина силы адгезии существенно зависят от концентрации связующих ионов у I оптимальное значение около 2 мМ для Zn) и показателя рН среды (оптимальное значение около 7,5).

На сегодняшний день использование катионов металлов для связывания макромолекул с подложкой является, пожалуй, наиболее распространенной методикой приготовления образцов при проведении АСМ исследований нуклеиновых кислот, что объясняется ее простотой и высокой воспроизводимостью результатов. Однако приводимые изображения макромолекул характеризуются завышенными латеральными значениями — 20−15 нм — и заниженными вертикальными — около 1 нм, в то время как диаметр одиночной молекулы ДНК около 2 нм. Завышение латеральных размеров полученных изображений, по всей видимости, обусловлено конечным размером радиуса кривизны кантеливера. Причиной занижения вертикальных размеров может являться деформация молекулы под действием силы адгезии к подложке и давления острия кантеливера. Следует подчеркнуть, что такие артефакты являются типичными при АСМ исследованиях молекул нуклеиновых кислот [33].

Другая широко используемая методика химической модификации подложки для стабилизации молекул нуклеиновых кислот на поверхности — это силанизация слюды [34]. Процесс силанизации не изменяет топографических особенностей поверхности слюды — она остается достаточно гладкой. В то же время улучшается связь макромолекулы с модифицированной подложкой, что повышает стабильность макромолекулы в процессе сканирования и обеспечивает возможность промывки поверхности, подлежащей исследованию. В работе [35] при проведении АСМ исследований нуклеиновых кислот (ДНК, двунитевой рибонуклеиновой кислоты (РНК)) в качестве подложки использовали поверхность слюды, химически модифицированную 3-аминопропилтриэтокси силаном (APTES). Модификация включала ковалентную привязку аминогрупп молекул APTES к слюде, степень модификации контролировалась с помощью АСМ и выбиралась таким образом, что шероховатость получаемой поверхности не затрудняла идентификацию исследуемых структур.

Было показано [36], что применяемая методика достаточно удобна для проведения исследований распределения молекул нуклеиновых кислот по длинам. Представленные авторами результаты совпадали с результатами электронной микроскопии (исследовались молекулы двунитевой РНК реовируса), при этом было показано, что при равенстве разрешающих способностей важным преимуществом АСМ является существенно менее сложная методика приготовления образцов.

Была продемонстрирована возможность использования модифицированной слюды при проведении исследований как на воздухе, так и в водной среде, — в обоих случаях величина адгезии молекул нуклеиновых кислот к подложке позволяла осуществлять сканирование в контактном режиме. Авторы [37] осуществляли сканирование одного и того же участка поверхности с адсорбированными макромолекулами на воздухе и в воде, при этом во втором случае наблюдалось увеличение разрешающей способности (примерно в три раза), что может быть связано с исключением негативного влияния капиллярных сил. Данные силы возникают из-за формирования водяного мениска между кантеливером и образцом за счет тонкой водной пленки, покрывающей поверхности при проведении исследований на воздухе. Как указывалось выше, капиллярные силы увеличивают силовое воздействие зонда на образец, что вызывает деформации макромолекулы или ее нестабильность в процессе сканирования и приводит к уменьшению разрешающей способности.

Другие исследователи так же сообщают, что если АСМ-исследования проводятся либо в сухой газовой атмосфере (часто для уменьшения относительной влажности температуру рабочей атмосферы повышают до 60−100 С), либо в жидкой ячейке, то влияние капиллярных сил уменьшается, что увеличивает достигаемое пространственное разрешение. Применение режима прерывистого контакта [38] также позволяет исключить влияние капиллярных сил.

Режим прерывистого контакта, применяемый для исследования в жидких средах, позволяет сегодня достичь разрешения, необходимого для визуализации витков двойной спирали ДНК [39].

На пути подбора адекватного подхода к приготовлению образцов может оказаться полезным накопленный за десятилетия багаж соответствующих методик электронной микроскопии. В упрощенном варианте многие из этих методик могут применяться и для решения задач зондовой микроскопии. Так, модифицированный метод Кляйншмидта (метод белковой пленки) дает хорошие результаты при использовании гидрофобных подложек [40].

Для разворачивания молекул ДНК на поверхности подложки применяют также хлорид бензилдиметилалкиламмония (ВАС) [41] -широко используемый в электронной микроскопии реагент, представляющий собой катионное поверхностно-активное вещество (ПАВ). ВАС в малых концентрациях (около 5−10″ 5%) добавляют непосредственно в раствор, содержащий макромолекулы перед нанесением их на поверхность слюды. Вследствие свойств ПАВ, на поверхности капельки, наносимой на подложку, формируется стабильная пленка молекул ВАС (со связанными с ней молекулами ДНК), которая потом распределяется по поверхности слюды и стабилизируется за счет сил электростатического взаимодействия. Добавление к рабочему раствору других ПАВ (в малых концентрациях) также способствует стабилизации молекул нуклеиновых кислот на поверхности слюды. Так, в работе [42] для разворачивания ДНК на поверхности успешно применили 2,4,6-трис (диметиламинометил)-фенол (ДМП-30) и хлорид цетилпиридиния (CP), представляющие собой, соответственно, ионное ПАВ.

В работе [43] для иммобилизации молекул ДНК применяли другую методику, сходную с традиционными для электронной микроскопии. Макромолекулы адсорбировали на поверхности слюды, сверху напыляли слой углерода. После этого на углерод приклеивалась стальная пластинка, слюда удалялась, и открытой для сканирования оказывалась внутренняя поверхность (обращенная прежде к слюде) углеродной пленки с жестко закрепленными в ней макромолекулами. Шероховатость поверхности приготовленной таким образом углеродной пленки составляла, по оценкам авторов, единицы ангстрем и допускала однозначную идентификацию отдельных молекул ДНК. Авторы работы отмечают высокую стабильность приготовленных образцов, — макромолекулы не разрушались при больших силах взаимодействия между кантеливером и образцом, результаты не зависели от среды исследования (эксперименты проводились как на воздухе, так и в жидкости), длительное хранение не влияло на качество образцов.

11.10. Применение зондовой микроскопии для исследования структуры и свойств молекул нуклеиновых кислот и их комплексов.

При использовании адекватной методики приготовления образцов сканирующий зондовый микроскоп представляет собой удобный и надежный прибор для исследования свойств биологических структур на молекулярном уровне. Убедительным доказательством этого утверждения могут служить результаты работ, посвященных исследованию конформационных свойств молекул нуклеиновых кислот и их комплексов с белками, поверхностно активными веществами и т. п.

Авторы работы [44] исследовали влияние определенных лигандов (дистамицина и микрогонотропена-бЬ) на конформационные свойства нескольких типов молекул ДНК с помощью АСМ в режиме прерывистого контакта. Результаты исследований не только обеспечили визуальное доказательство влияния данных лигандов на конформацию ДНК, но и позволили сделать определенные качественные оценки, основанные на анализе представленных авторами гистограмм распределения расстояния между концами ДНК. Возможность набора статистики, основанной на анализе большого количества изображений отдельных молекул ДНК (100.

200 и более), повышает достоверность интерпретации полученных результатов и свидетельствует о высокой надежности метода.

В работе [45] исследовали комплексы РНК-полимеразы из Е. coli с ДНК, содержащей X Pl промотор. Образованные комплексы были визуализированы методом АСМ, на полученных изображениях наблюдали молекулы ДНК с РНК-полимеразой, локализованной на расстоянии 4/9 от одного из концов. Проводился анализ структуры комплекса РНК полимеразы и ДНК как в открытых комплексах, связанных с промотором (OPCs), так и в стабильных элонгационных комплексах (С 15) с образованным 15-нуклеотидным транскриптом. Было показано, что в области прикрепления РНК-полимеразы происходит изгиб молекулы ДНК, причем средний угол изгиба для OPCs и С15 составлял 54±31° и 92±37°, соответственно (распределение угла изгиба для того же участка шаблона в отсутствие РНК-полимеразы является гауссовым с центром в 0°). На расстоянии обнаруженного различия в значениях средних углов изгиба для OPCs и С15 авторы делают вывод, что процесс транскрипции сопровождается изменением структуры комплекса РНК-полимеразы с ДНК, обусловленной конфармационными изменениями полимеразы.

Авторы работы [46] применили ряд методик для исследования конформационных свойств комплексов ДНК-ПАВ. Было показано, что при взаимодействии ДНК с ПАВ происходит сворачивание макромолекулы в компактный тороидальный комплекс. Вывод о тороидальной структуре данных компактизированных комплексов сделан именно на основании результатов АСМ. Наряду с этим было обнаружено, что тороподобные комплексы ДНК-ПАВ, образованные в водной фазе, растворимы в хлороформе, в то время как ДНК в отсутстие поверхностно-активных веществ в хлороформе не растворяется [47]. В случае образования этих комплексов в двухфазной системе вода/хлороформ гидрофобные частицы комплекса ДНК-ПАВ оказываются нерастворимыми в водной среде и переходят в малополярный органический растворитель — хлороформ, пересекая границу раздела фаз. Методы АСМ позволили визуализировать тороподобные комплексы ДНК-ПАВ, перешедшие через границу раздела фаз в хлороформ [48].

Подобные исследования с применением зондовой микроскопии для изучения конформационных превращений молекул ДНК в различных средах, моделирующих внутреннюю часть липидного бислоя биологических мембран, открывает уникальную возможность для понимания трансмембранного переноса [49].

Возможность АСМ-визуализации молекулярных процессов продемонстрирована в работе [50] на основе последовательного анализа процесса образования неспецифических комплексов молекулы ДНК и РНК-полимеразы в реальном масштабе времени. Схема эксперимента включала в себя адсорбцию макромолекул ДНК на слюду из 10 мМ HEPES буфера в присутствии ионов магния, затем следовали промывка и высушивание образцов в эксикаторе. После этого образцы перемещали в жидкостную ячейку микроскопа, начинали процесс сканирования, а затем в раствор вводили РНК-полимеразу. Было показано, что образование комплексов белок-ДНК наблюдается уже через несколько секунд после добавления полимеразы, что свидетельствует о сохранении нативной конфигурации РНК-полимеразы и ДНК в процессе приготовления образцов и проведения исследований. На основе анализа распределения участков связывания белка относительно концов ДНК делается вывод о преобладании неспецифичного взаимодействия, однако диффузия РНК-полимеразы вдоль молекулы ДНК не наблюдалась, что, возможно, объясняется влиянием подложки. Данные результаты демонстрируют возможность использования АСМ для исследования процессов, ответственных за распознавание и сборку макромолекулярных комплексов в физиологических условиях.

Выводы.

1. Разработаны методы модификации слюдяных и пирографитовых АСМ подложек, позволяющие существенно повысить их адсорбционные свойства, не нарушая при этом наружный слой кристаллической решетки. Такие положки могут быть эффективно применены для АСМ исследований не только вирусов, но и таких биомолекул, как ДНК, белки, бактерии и т. д.

2. Показано, что при исследовании биообъектов методами атомной силовой микроскопии, предпочтительнее использовать пирографитовые подложки, т.к., за счет своей инертности, графитовая поверхность оказывает на образец гораздо меньшее разрушительное воздействие, чем слюда.

3. Установлено, 4to головки бактериофагов Phi KZ и Т4, нанесенные на один и тот же тип АСМ подложки, сжимаются по разному, что может свидетельствовать о различной плотности заполнения капсидов фагов. Обсуждены возможные причины этого явления.

4. Методами АСМ получены изображения адсорбированных на слюде или пирографите ассоциатов, образуемых в водных растворах симметричными тетраантенными олигоглицинами [H-Glyn-NHCH2]4C, и сиалоолигоглицинами [Neu5Aca-spaser-Glyn-NHCH2]4C (п = 7−9). Охарактеризованы вертикальные и горизонтальные параметры ассоциатов, их жесткость, а также структурные особенности.

5. Методами АСМ установлено, что в зависимости от технологии присоединения нейраминовой кислоты к полиглициновой матрице, сиалоолигоглициновые ассоциаты могут находится в двух структурных формах: плоские протяженные слои нерегулярной формы, постоянной высоты 7,3±0,3 нм. (Форма А), или мелкие дискретные, относительно гомогенные по размерам плоские частицы, фиксированной высоты 6,7±0,6 нм (Форма Б).

6. Предложена модель строения ассоциата, в которой полиглициновые цепи, включенные в систему межмолекулярных водородных связей ориентированы вертикально (по оси Z) и образуют протяженный (по осям X, Y) слой, а терминальные глицины или углеводные заместители, располагаются по обе стороны поверхности листа ассоциата.