Направления использования PCR

Диагностика болезней (DNA-диагностика). Метод основан на том, что первичная структура DNA разных видов организмов различна. Значит, можно найти последовательности, характерные для DNA возбудителей болезни и подобрать такие праймеры, которые будут гибридизоваться с DNA возбудителя, но не с DNA человека. В этом случае продуктом амплификации будет DNA только возбудителя, а не пациента.

Изучение генома человека. Для этого необходимо выделение и амплификация отдельных генов. Используются праймеры, комплементарные началу изучаемого гена. Последовательность нуклеотидов в таком праймере можно определить по аминокислотной последовательности N-конца и С-конца соответствующего белка и таблице кода. Трудность заключается в том, что код вырожденный и приходится синтезировать несколько праймеров, а затем опытным путем находить праймеры, комплементарные концам гена. Выделение и анализ отдельных фрагментов генов используется для определения мутации и диагностики наследственных болезней.

Клонирование генов

Фрагменты DNA можно вырезать из генома эукариот специально подобранными рестриктазами и встраивать в DNA плазмиды или вируса вскрытую (разрезанную) теми же рестриктазами.

Рис. Получение рекомбинантной DNA

Образуется гибридная плазмида или рекомбинантная DNA. Однако таким способом получается очень небольшое количество рекомбинантной DNA. Клонирование — это способ ее накопления. Для этого рекомбинантные плазмиды встраивают в бактерии и получают рекомбинантные бактерии, которые реплицируют, транскрибируют и транслируют Lчужие гены.

Из бактериальной массы можно выделить достаточное количество рекомбинантной DNA.

Рис. Схема синтеза препроинсулина в трансформированных клетках E. Coli

Плазмиды кольцевые, двухцепочечные молекулы DNA, содержащиеся в бактериальных клетках и способные к репликации и транскрипции, независимо от клеточных хромосом.

Обратная транскриптаза (RNA-зависимая DNA-полимераза) — фермент, катализирующий синтез DNA, используя в качестве матрицы RNA. Этот фермент необходим для получения последовательности DNA, комплементарной mRNA (kDNA), применяемой в генной инженерии. С помощью обратной транскриптазы можно получить kDNA-копии mRNA, в которой отсутствуют интроны. Следовательно, при включении в плазмиды эта молекула не подвергается сплайсингу. Рекомбинантные микроорганизмы нашли практическое применение как продуценты необходимых человеку веществ: белковых гормонов, биологически активных пептидов.