Разработка методов контроля качества вакцины в лабораторных условиях

Методы контроля вакцины разрабатывали на основании требований, предъявляемых к ветеринарным препаратам, которые изложены в инструкции «О порядке регистрации ветеринарных препаратов в Республике Беларусь», Европейской Фармакопеи.

Разработаны следующие методы контроля вакцины сухой живой против классической чумы свиней из лапинизированного вируса: внешний вид, наличие посторонних примесей, трещин флаконов, массовая доля влаги, растворимость, стерильность, безвредность, биологическая активность вакцины по титру инфекционности для кроликов, иммуногенная активность (таблица 1).

Таблица 1 — Методы контроля вакцины сухой живой против классической чумы свиней Наименования показателя Характеристика и норма показателя.

• 1 Внешний вид и цветСухая гомогенная мелкопористая масса от светло-желтого до коричневого цвета
• 2 Наличие посторонних примесейНе допускается
• 3 Влажность, %2,5 — 3,04 Растворимость, мин1,5 — 2,05
• 4 Наличие вакуума во флаконах (ампулах) с вакцинойПри облучении флаконов (ампул) с вакциной наблюдается фиолетово-синее свечение и потрескивание
• 5 СтерильностьНа питательных средах с посевами из вакцины не допускается рост бактерий или грибов
• 6 Титр вируса в вакцинеНе менее 103.0ИД50/см3
• 7 БезвредностьВведение поросятам внутримышечно вакцины в объеме по 5,0 см³, подкожно белым мышам — по 0,5 см³, подкожно кроликам по 1,0 см³ не должна вызывать видимых изменений в месте инъекции и изменений общего состояния животных в течение последующих 10 суток. Вакцина считается безвредной, если все поросята в течение 14 суток — клинически здоровы
• 8 Иммуногенная активностьВакцина считается иммуногенной, если в сыворотках крови иммунизированных поросят процент блокировки антител имеет значение не менее 40.

Внешний вид вакцины, наличие посторонних примесей определяли визуально.

Растворимость вакцины определяли путем добавления во флаконы (ампулы) с вакциной 10,0 мл физиологического раствора хлорида натрия и определения времени растворимости в течении 1−3 минут.

Наличие вакуума во флаконах, с вакциной определяли согласно ГОСТ 28 083–89 «Препараты биологические. Методы контроля вакуума в ампулах и флаконах» .

Массовую долю влаги определяли по ГОСТ 24 061–89 «Препараты биологические. Метод определения влажности» .

Для определения безвредности брали 10 флаконов с вакциной, в каждый добавляли по 2 мл физраствора. После растворения содержимое всех флаконов переносили в стерильный стеклянный флакон и тщательно перемешивали. Полученную смесь использовали для испытания.

Безвредность вакцины определяли на пяти мышах массой 18−20 г путем подкожного введения 0,5 см³ вакцины, на двух кроликах массой 2,0−2,5 кг — 1 см³, и двух поросятах 3−4-недельного возраста, путем внутримышечного введения в область шеи вакцины в объеме 2 см³.

Вакцина считается безвредной, если все животные в период наблюдения (10−14 дней) останутся клинически здоровыми. На месте введения не должно быть каких-либо изменений (отека, эритем, уплотнений). У части поросят возможно кратковременное на 1−2 сутки после введения вакцины повышение температуры тела на 0,5−1,0оС.

Активность вакцины определяли титрованием вакцины на взрослых кроликах. Содержимое 5 флаконов растворяли добавлением 2 см³ стерильного физраствора, смешивали в общем флаконе и из этой смеси готовили возрастающие 10-кратные разведения от 10−1 до 10−5. Каждое разведение 10−3, 10−4 и 10−5 вводили внутривенно в объеме 1 см³ трем кроликам. Начиная со вторых суток, у животных ежедневно 3 раза измеряли температуру тела в течение 4-х дней. У кроликов, реагирующих на введение вакцины, температура тела должна повышаться до 41,5єС.

На основании полученных данных термометрии по методу Рида и Менча рассчитывали титр вируса вакцины. Титр вируса в вакцине должен быть не менее 103,0 ИД 50/смЗ.

Определение контаминации вакцины бактериальной и грибковой микрофлорой. Пять флаконов отдельно растворяли в растворе Хенкса или в среде Игла, или среде 199. Для этого в каждый флакон с вакциной, добавляли 10 мл указанного раствора рН 7,2. Затем производили посев из каждого флакона вакцины в количестве 0,3−0,5 см³ в пробирки с МПА, МПБ, МППБ, Сабуро и во флаконы в количестве 2−5 см3 с МПБ и МППБ. Посевы производили в две пробирки и в один флакон с каждой средой из одного флакона вакцины. Питательные среды с посевами выдерживали в течение 10 суток в термостате при плюс 37−38°С (для агара Сабуро — плюс 20−22°С). В питательных средах с посевами не должно быть роста бактериальной и грибковой микрофлоры.

Иммуногенность вакцины проверяли на четырех серонегативных (2 из них контрольных) подсвинках массой 25−35 кг, возраст не моложе 60 дней, вакцинированных одной прививной дозой в объеме 2 см³. За иммунизированными животными велось наблюдение в течение 21 дня.

Через 21 сутки были отобраны пробы крови от вакцинированных и не вакцинированных поросят с целью получения сыворотки крови для исследования на наличие антител в ИФА. Вакцина считается иммуногенной, если в сыворотках крови иммунизированных поросят процент блокировки (связывания) антител имеет значение не менее 40.

Подопытных животных содержали по 2−3 головы в виварии РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского». Помещения тщательно очищали механически, промывали водой, дезинфицировали 5%-ным раствором едкого натрия. Животные получали комбикорм, овощи и воду.

Статистическую обработку полученного цифрового материала производили с использованием программного пакета Microsoft Office XP (Excel).