Определение строения белков

Определение строения белков является очень сложной задачей, но за последние годы в химии белка достигнуты значительные успехи. Помимо методов получения высокомолекулярных синтетических полипептидов, построенных из большого числа молекул одинаковых а-аминокислот, разработаны методы синтеза смешанных полипептидов с заранее заданным порядком чередования различных а-аминокислот путем постепенного их наращивания.

Полностью определена химическая структура нескольких белков: гормона инсулина, антибиотика грамицидин, фермента, расщепляющего нуклеи новые кислоты, рибонуклеазы, гормона аденокортикотропина, белка вируса табачной мозаики, миоглобина, гемоглобина и др. Частично определена структура некоторых других белков.

Изучение химического строения белка начинают с определения аминокислотного состава. Для этого используется главным образом метод гидролиза, т. е. нагревание белка с 6—10 моль/л соляной кислотой при температуре 100—110°С. Получают смесь а-аминокислот, из которой можно выделить индивидуальные аминокислоты.

Например, полный гидролиз одного трипептида приводит к образованию трех аминокислот:

Для количественного анализа этой смеси в настоящее время применяют ионообменную и бумажную хроматографию. Сконструированы специальные автоматические анализаторы аминокислот.

Итак, гидролиз белков, по существу, сводится к гидролизу полипептидных связей. К этому же сводится и процесс переваривание.

Разработаны также ферментативные методы ступенчатого расщепления белка. Некоторые ферменты расщепляют макромолекулу белка специфически — только в местах нахождения определенной аминокислоты. Так получают продукты ступенчатого расщепления — пептоны и пептиды, последующим анализом которых устанавливают их аминокислотный состав.

Значительно более сложным является определение последовательности амидокислот в пептидных цепях белка. С этой целью, прежде всего, определяют Nи С-концы полипептидных цепей, при этом решаются два вопроса—идентифицируются концевые аминокислоты и определяется число пептидных цепей, входящих в состав макромолекул белка. Для определения N-концов пептидной цепи получают N-производное концевой аминокислоты пептида, которое идентифицируют после полного гидролиза пептида. С-концы пептидных цепей определяются избирательным отщеплением концевой аминокислоты с помощью специфического фермента — карбоксипептидазы и последующей идентификацией этой аминокислоты. Если макромолекула белка состоит из двух (или более) пептидных цепей, как в случае инсулина, то избирательно разрушают дисульфидные мостики окислением (например, над муравьиной кислотой) и затем полученные полипептиды разделяют путем фракционирования на ионитах. Для определения последовательности расположения аминокислот в каждой полипептидной цепи ее подвергают частичному кислотному гидролизу и избиратель ному расщеплению с помощью ферментов, каждый из которых разрывает полипептидную цепь только в определенных местах присоединения какой-то одной определенной аминокислоты или одного типа аминокислот (основных, ароматических). Таким образом, получают несколько наборов пептидов: которые разделяют, используя методы хроматографии и электрофореза. Строение коротких пептидов определяют последовательным отщеплением и идентификацией концевых аминокислот упомянутыми выше методами, а большие пептиды подвергают дополнительному расщеплению с последующим разделением и определением строения. Затем путем сложного сопоставления структуры различных участков пептидной цепи воссоздают полную картину расположения аминокислот в макромолекуле белка. Работа эта очень трудоемкая, и для определения химической структуры белка требуется несколько лет.

Для изучения пространственной структуры белка, последовательности соединения аминокислот в том или ином белке используют различные физико-химические методы, из которых наиболее эффективными оказались метод ступенчатого расщепления и рентгеноструктурный анализ.

Рентгеноструктурный анализ — метод исследования атомной структуры в-ва с помощью дифракции рентгеновских лучей. Рентгеновские лучи взаимодействуют с электронными оболочками атомов. В результате этого взаимодействия происходит дифракция рентгеновских лучей и на фотопленке получается дифракционная картина — пятна или окружности. Из дифракционной картины при помощи сложных расчетов устанавливают распределение электронной плотности в-ва, а по ней — род атомов и их расположение.

В настоящее время установлено, что большинство белков состоят из 22 качественно разных а-аминокислот.

При образовании молекулы белка или полипептида а-аминокислоты могут соединяться в различной последовательности. Возможно огромное число различных комбинаций. Так же как, пользуясь 20…30 буквами алфавита, можно написать текст любой длины, так и из 20 а-аминокислот можно образовать больше 1018 комбинаций. Существование различного типа полипептидов практически неограничено.

Определение наличия белка:

Для идентификации белков и полипептидов используют специфические реакции на белки. Например:

• а) биуретовая реакция
• б) ксантопротеиновая реакция (появление желтого окрашивания при взаимодействии с онцентрированной азотной кислотой, которое в присутствии аммиака становится оранжевым; реакция связана с нитрованием остатков фенилаланина и тирозина);
• в) реакция Миллона (образование желто-коричневого окрашивания при взаимодействии с Hg (NО3)2+HNО3+HNO2
• г) нингидриновая реакция
• д) при нагревании белков со щелочью в присутствии солей свинца выпадает черный осадок PbS, что свидетельствует о присутствии серусодержащих аминокислот.
• е) сильное нагревание вызывает не только денатурацию белков, но и разложение их с выделением летучих продуктов, обладающих запахом жженых перьев.

Белки обычно образуют коллоидные растворы. Многие реагенты вызывают осаждение белков — коагуляцию, которая может быть обратимой и необратимой. Например, этанол и ацетон коагулируют белки, но эта коагуляция является обратимой. В чистой воде коагулированные этим способом белки снова образуют коллоидный раствор. Обратимую коагуляцию вызывают также растворы некоторых солей (MgSO4 (NH4)2SO4 Na2SO4). Необратимую коагуляцию (денатурацию) белка вызывает кипячение, а также действие минеральных кислот, пикриновой кислоты, солей тяжелых металлов, танина.