Методы создания анаэробных условий

В зависимости от способа создания безвоздушной среды, все методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий делят на физические, химические и биологические.

Особняком стоит метод Китта-Тароцци, сочетающий в себе физические, химические и биологические способы создания безвоздушной среды обитания микроорганизмов.

Воздух, точнее кислород воздуха, можно удалить из среды культивирования бактерий физическими методами.

• · Можно использовать анаэростат — сосуд с герметической крышкой, из которого отсасывают воздух насосом. В такой сосуд помещают чашки Петри с посевами и после откачивания воздуха ставят (если он по своим размерам позволяет это сделать — такие небольшие анаэростаты называются микроанаэростатами) в термостат, где происходит культивирование бактерий.
• · Существуют, по сути, разновидности анаэростатов, в которых удаленный воздух замещается каким-нибудь инертным газом, например — в аппарате Кипа — водородом.
• · Один из наиболее распространенных способов создания анаэробных условий при культивировании бактерий используется в так называемых трубках Виньяль-Вийона. Этот метод прост в осуществлении и не требует какой-либо особой аппаратуры. В трубках Виньяль-Вийона осуществляется глубинное культивирование бактерий. Для этого бактериальная культура разводится в расплавленной и охлажденной питательной среде (в пробирках или пипетках — отсюда и название «трубки») с таким расчетом, чтобы бактериальные клетки находились на значительном удалении одна от другой. При застывании питательной среды бактериальные клетки оказываются «замурованными» в ее толще и при культивировании каждая из них формирует отдельную колонию (естественно, без доступа кислорода воздуха).
• · Анаэробные условия для культивирования бактерии создаются и в случае их засева уколом в высокий столбик полужидкого агара. Место укола тут же затягивается и бактерии растут в толще питательной среды.
• · Удалить воздух, растворенный в жидкой питательной среде, можно с помощью кипячения. При нагревании жидкости растворенный в ней воздух выходит в атмосферу, что мы и наблюдаем в виде «бурления». Такой процесс называется регенерацией питательной среды. Чтобы впоследствии при медленном охлаждении воздух вновь не растворился в питательном бульоне, его охлаждают очень быстро (например, под струей холодной воды).
• · Чтобы свести к минимуму диффузию атмосферного воздуха в питательную среду, ее поверхность покрывают слоем жидкого масла (например, вазелинового). В этом случае говорят о «культивировании под слоем масла».
• · При глубинном культивировании бывает трудно получить доступ к нужной колонии и извлечь ее из толщи питательной среды. Облегчает эту задачу метод Перетца: в чашку Петри заливается расплавленная и охлажденная питательная агаризованная среда, смешанная с бактериальной культурой, на поверхность которой осторожно помещается предметное стекло, которое слегка вдавливают в питательный агар. Те колонии, которые вырастают непосредственно под этим стеклом, после снятия последнего становятся легко доступными.

Химические методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий делятся на две группы.

• 1. Для связывания кислорода воздуха можно провести в замкнутом объеме (например, в эксикаторе с притертой крышкой) химическую реакцию, которая протекает с поглощением воздуха.
• · В методе Аристовского с этой целью используются сыпучие ингредиенты. В развитие этого метода современная микробиологическая промышленность выпускает специальные наборы, с помощью которых можно создать газовую смесь, как с полным отсутствием кислорода, так и с присутствием его, а также углекислого газа и азота, в определенных концентрациях, необходимых для культивирования бактерий с «нестандартными» требованиями к условиям аэрации.
• · В методе Омелянского с этой целью используются жидкие ингредиенты (пирогаллол и едкое кали).
• 2. Можно добавить в жидкую питательную среду вещества, связывающие кислород. Такие вещества называются редуцирующими. К ним относится, например, глюкоза, тиогликолевая кислота и ряд других.

В качестве биологического метода создания анаэробных условий для культивирования бактерий наиболее распространен (в различных модификациях) метод Фортнера. Принцип его состоит в том, что в замкнутом объеме (например, в парафинированной чашке Петри) одновременно культивируются анаэробы и так называемый «жадный аэроб» — вид бактерий, усиленно поглощающий при своем росте кислород. В качестве последнего наиболее часто используется энтеробактерия Serracia marcescens. Аэроб уничтожает весь кислород замкнутого объема, создавая тем самым условия для роста анаэроба.

Метод Китта-Тароцци заключается в использовании для культивирования анаэробов одноименной питательной среды. Среда Китта-Тароцци состоит из мясопептонного бульона, содержащего глюкозу (в качестве редуцирующего вещества), регенерированного и залитого слоем масла, на дно пробирки помещают кусочки паренхиматозного органа (чаще — печени) для адсорбции растворенного в мясопептонном бульоне воздуха.