Антиоксиданты. 
Свободные радикалы и антиоксиданты

Основные типы антиоксидантов

По определению, антиоксиданты — это соединения, которые препятствуют образованию свободных радикалов и таким образом предотвращают развитие болезней, вызываемых повреждением свободными радикалами структур наших клеток [43].

Антиоксидантами называют многие как водорастворимые, так и гидрофобные соединения, действие которых в конце концов приводит к снижению скорости образования свободных радикалов и уменьшению концентрации продуктов реакций, протекающих с участием радикалов.

На рис. 5 приведены защитные системы клеток, препятствующие образованию вторичных (гидроксильных) радикалов в водной фазе; на рис. 6 — агенты, тормозящие образование вторичных (липидных) радикалов в гидрофобной фазе биологических мембран и липопротеинов. Рассмотрим эти схемы подробнее.

1 — 4 — реакции супероксидного радикала, приводящие к образованию гидроксильного радикала в водной среде. 1 — 2 — восстановление трехвалентного железа до двухвалентного. 3 — разложение перекиси водорода (реакция Фентона). Альтернативнапя реакция взаимодействия ионов железа с гипохлоритом на схеме не показана. 4 — реакции гидроксильного радикала, в том числе инициирование цепного окисления липидов (см. рис. 6). 5 — удаление супероксидных радикалов с образованием перекиси водорода, катализируемое супероксиддисмутазой. 6 — 7 — удаление перекиси водорода каталазой (6) и пероксидазами (7). 8 — связывание ионов железа комплексонами.

Реакции 5 — 8 — приводят к торможению образования радикалов гидроксила. Набранные полужирным шрифтом соединения являются антиоксидантами.

Первично образуемый супероксид, как уже говорилось, способен восстанавливать ионы трехвалентного железа (рис. 5, реакция 1) из депо и различных комплексов (исключая гемовое железо) с образованием ионов Fe2+ (2). Последнее может реагировать с перекисью водорода (реакция 3) или гипохлоритом (на схеме не показано) с образованием гидроксильного радикала. Радикал гидроксила оказывает повреждающее действие на многие компоненты клетки и, в частности, способен инициировать цепное окисление (пероксидацию) липидов в биологических мембранах и липопротеинах (6).

Супероксиддисмутаза тормозит развитие этих событий, поскольку удаляет супероксидный радикал из системы (реакция 5) с образованием перекиси водорода, которая в свою очередь удаляется благодаря активности каталазы (6) и пероксидаз (7), в первую очередь глутатион-пероксидазы. Экспериментально показано, что в очень многих системах комбинация СОД + каталаза снижают уровень продуктов пероксидации липидов и предотвращают другие последствия действия свободных радикалов.

С другой стороны, торможение образования вторичных радикалов может быть достигнуто связыванием и удалением ионов железа (8). В модельных системах это могут осуществлять такие комплексоны, как ЭДТА или десферриоксамин (известный также под названием «десферал»). В живых клетках это же может осуществляться другими соединениями, из которых наиболее изучен дипептид карнозин, к чему мы еще вернемся. Все перечисленные соединения (СОД, каталаза, глутатион-пероксидаза + восстановленный глутатион, соединения, связывающие железо) могут в соответствующих условиях снижать уровень образования вторичных радикалов и пероксидацию липидов, а потому относятся к категории антиоксидантов.

Этим дело не исчерпывается. Даже если гидроксильные радикалы образовались и запустились реакции цепного окисления липидов, еще не все потеряно для клетки и организма, т. к вступает в строй новая система антиоксидантов.

1 — инициирование цепного окисления липидов радикалами гидроксила. 2 и 3 — реакции продолжения цепи окисления липидов. 4 — реакция разветвления цепи ионами двухвалентного железа (разложение гидроперекиси липида с образованием липоксильного радикала). 5 — 7 — реакции обрыва цепей в результате «перехвата» радикалов, ведущих цепи окисления, молекулами антиоксидантов — «ловушек» радикалов. 8 — удаление гидроперекисей липидов за счет их восстановления тиоловыми соединениями, в частности, восстановленным глутатионом; эта реакция катализируется ферментом глутатион-пероксидазой. Удаление гидроперекисей предотвращает разветвление цепей и тем резко тормозит процесс пероксидации липидов. 9 — связывание ионов железа комплексонами, которое также препятствует разветвлению цепей.

Все соединения, обведенные рамкой, тормозят свободно-радикальное окисление (пероксидацию) липидов и таким образом служат антиоксидантами.

Схематически реакции липидной пероксидации и участки действия антиоксидантов приведены на рис. 6. Появление свободных радикалов в липидной фазе мембран приводит к инициированию цепной реакции (стадия 1 на рис. 6), которая развивается благодаря чередующимся реакциям продолжения цепи (2 и 3). В присутствии двухвалентного железа происходит разложение гидроперекисей (4), сопровождающееся образованием радикалов, дающих начало новым цепям окисления. Наиболее радикальный способ торможения цепных реакций заключается в связывании («захвате») радикалов, ведущих цепи окисления, которое способны осуществлять такие восстановители, как фенол и его производные. Синтезировано и изолировано из живых объектов множество подобных соединений, называемых «ловушками радикалов», «ингибиторами свободнорадикальных реакций», «липидными антиоксидантами», которые резко тормозят реакции липидной пероксидации в весьма низких концентрациях. Менее радикальный (в прямом и переносном смысле) путь торможения пероксидации липидов заключается в предотвращении процесса разветвления цепей за счет либо удаления гидроперекисей (реакция 8 на рис. 6), либо связывания железа (реакция 9). Удаление гидроперекисей ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов биологических мембран происходит, по-видимому, в результате комбинированного действия фермента фосфолипазы А₂, отщепляющей окисленную жирную кислоту от фосфолипида (благодаря чему она выходит из липидного слоя мембран в окружающую водную среду), и глутатион-пероксидазы, которая восстанавливает гидроперекись до спирта за счет окисления глутатиона. Лимитирующей стадией последнего процесса в клетках обычно служит концентрация глутатиона, снижение которой, как правило, сопровождается активацией липидной пероксидации [21]. Опять-таки, все перечисленные соединения (ловушки радикалов, соединения связывающие железо, глутатион) могут быть названы антиоксидантами: их действие сходно, хотя они вступают в разные реакции.

Изучение активности антиоксидантов путем измерения кинетики хемилюминесценции

Существует много методов измерения активности естественных и синтетических антиоксидантов. В наших исследованиях в качестве основного метода использовалось измерение кинетики неактивированной хемилюминесценции, сопровождающей цепное окисление липидов, инициированное ионами Fe²⁺ в суспензиях митохондрий печени крысы [2,3,18,29,30,55,56], желточных липопротеидов [27,32,54] или фосфолипидных липосом. В качестве критериев действия антиоксидантов брали увеличение длительности латентного периода перед развитием медленной вспышки ХЛ, амплитуду или светосумму этой вcпышки. Была оценена относительная антиоксидантная активность стероидов, тироксина, дигидрои дигидроксипиридинов, глицерофосфолипидов (там же), [12], и целого ряда других антиоксидантов (см. обзоры [42] и [44]).

Комплексоны

В перечисленных случаях антиоксиданты действовали в основном как ловушки радикалов. Существует однако другая группа антиоксидантов, которые тоже снижают образование радикалов, однако совершенно иным способом, а именно, связывая ионы железа, которые участвуют в реакциях новообразования радикалов из перекисей. К таким соединениям относятся ЭДТА, ортои особенно пирофосфаты [19], десферриоксамин (десферал) [35], антибиотик тетрациклин [13] и некоторые другие комплексоны. В среде, содержащей молекулярный кислород, все эти соединения, связывая двухвалентное железо, ускоряют его аутоокисление. И хотя в этих реакциях железо удаляется, при этом образуются супероксидные радикалы, что тоже не очень хорошо. Все же супероксидные радикалы, вероятно, меньшее зло по сравнению с самим двухвалентным железом, продуцирующим в присутствии гипохлорита или перекисей гидроксильные и липидные радикалы, гораздо более опасные. Характерно, что ферментные системы самого организма: церрулоплазмин плазмы крови и клеточный ферритин, призванные окислять двухвалентное железо, делают это без образования каких бы то ни было радикалов [51].

К природным соединениям, способным связывать ионы двухвалентного железа, относится карнозин (?-аланил-гистидин). Этот дипептид содержится в мышечной ткани в миллимолярных концентрациях, и вот уже более полувека интригует исследователей, потому что его благоприятное воздействие на многие процессы жизнедеятельности доказано, а механизм этого действия непонятен. В последние годы появились сообщения об антиоксидантном действии карнозина, но молекулярный механизм этого действия оставался предметом дискуссии. После обсуждения этой проблемы с С. Е. Севериным, нами была исследована кинетика хемилюминесценции, сопровождающей перекисное окисление суспензии липидов, к которым добавляли ионы двухвалентного железа и разные концентрации карнозина [24]. В противоположность антиоксидантам-ловушкам радикалов, таким как ?-токоферол или бутилированный гидрокситолуол, карнозин не увеличивал, а уменьшал латентный период перед наступлением медленной вспышки ХЛ; в этом отношении он действовал аналогично уменьшению концентрации вводимого железа. Был сделан вывод, что антиоксидантное действие карнозина имеет иную природу, чем действие ловушек радикалов и основано на связывании им ионов двухвалентного железа (там же). Половинное связывание железа наблюдалось при концентрации карнозина 2,3 мМ, что примерно на порядок величины меньше концентрации этого дипептида в мышечных клетках. Таким образом, антиоксидантные свойства карнозина могут быть объяснены тем, что связывая ионы железа, он препятствует образованию вторичных радикалов в биологических системах.

Таким же действием на кинетику ХЛ обладали и другие соединения, связывающие ионы железа: ЭДТА и десферал (данные в печати).

Изучение механизма действия антиоксидантов методом математического моделирования кинетики пероксидации липидов

В последнее время механизм действия антиоксидантов изучается в нашей лаборатории путем сопоставления кинетических кривых хемилюминесценции с результатами математического моделирования процесса [44]. С помощью специально разработанной компьютерной программы для математического моделирования кинетики сложных систем реакций моделировали кинетику цепного окисления липидов при различных гипотетических схемах действия антиоксидантов-ловушек радикалов. Общим для всех схем было хорошо доказанное образование радикалов антиоксиданта (In*) при его взаимодействии с радикалами, ведущими цепи окисления (LO₂*):

LO₂* + InH LOOH + In* ;

Но дальнейшая судьба этого радикала может быть разной. При моделировании процесса с использованием трех гипотетических схем, составленных с учетом литературных данных и высказываний разных авторов (см. таблицу 4), оказалось, что результаты, соответствующие опытам с ?-токоферолом, могут быть получены только при использовании Схемы 2, согласно которой радикал антиоксиданта вступает в реакцию с гидроперекисями липида, давая новые липидные радикалы.

Таблица 4. Схемы реакций взаимодействия антиоксиданта с липидными радикалами.

Схема 1	Схема 2	Схема 3

Это приводит к замедлению процесса без уменьшения общего содержания радикалов в системе, что и наблюдается по хемилюминесценции [29]. Другие схемы не согласуются с экспериментом.

В самое последнее время, сравнивая экспериментальные данные, полученные с использованием разных антиоксидантов, с результатами математического моделирования, мы пытаемся найти константы скоростей реакций антиоксидантов с радикалами (что делали другими способами и раньше) и константы скорости радикалов антиоксидантов с пероксидами липидов (что раньше не делалось). Предварительные результаты этих исследований описаны в работе [29].