Способы получения трансгенных животных

Современные методы селекции сельскохозяйственных животных базируются на использовании внутривидовой генетической изменчивости. Как правило, виды генетически изолированы друг от друга и не скрещиваются между собой, так как этому препятствует репродуктивная изоляция. В классической селекции, где используют для скрещивания животных с половой совместимостью, нельзя применять межвидовую генетическую изменчивость и создавать новые генетические формы, так как рекомбинация генов происходит только между хромосомами животного одного вида. Преодолеть биологические границы видов и использовать межвидовую генетическую изменчивость для создания новых форм животных можно с помощью переноса генов. Под переносом чужеродного гена понимают пересадку in vitro рекомбинацией конструкции гена в клетки другого животного вне зависимости от его видовой принадлежности. Если рекомбинантная конструкция гена интегрировалась в геном другого животного, то такой ген обозначается как трансген. Кодируемый трансгеном белок носит название трансгенного продукта. Животное, которое содержит в своем геноме трансген, называется трансгенным. Если животные передают трансгены своим потомкам, то образуются родственные группы трансгенных животных — трансгенные линии.

Особо важное место среди этих исследований сразу же заняли работы по получению трансгенных млекопитающих. Это направление биотехнологии возникло, с одной стороны, на основе бурного развития экспериментальной эмбриологии, а с другой — на основе достижений молекулярной генетики. Еще в 60-е годы XX века были разработаны методы получения ранних эмбрионов мыши, их культивирования in vitro на синтетических средах, методы пересадки этих эмбрионов самкам-реципиентам. Позднее они были адаптированы для многих видов крупных сельскохозяйственных животных. В то же время достижения генной инженерии позволили создавать генные конструкции, состоящие из рекомбинантной ДНК определенного гена и различных управляющих последовательностей, регулирующих его работу. Так, Пальмитер с соавторами вводили в зиготы мыши ген гормона роста крысы, подсоединенный к металлотиониновому промотору. После пересадки эмбрионов приемной матери родились трансгенные мышата нормального размера. После окончания вскармливания материнским молоком эти мышата получали корм с высоким содержанием цинка, который стимулировал работу металлотионинового промотора. Ген крысы активировался, продукция пептидного гормона роста резко увеличивалась, и в возрасте 10 недель трансгенные мыши были в два раза крупнее, чем контрольные Для переноса генов млекопитающих используют три метода:

• 1. микроинъекцию рекомбинантной ДНК в пронуклеос зиготы;
• 2. использование ретро вирусов в качестве векторов;
• 3. инъекцию трансформированных эмбриональных стволовых клеток в эмбрион.

Все методы переноса генетической информации млекопитающих охватывают ранние этапы онтогенеза — от оплодотворенной яйцеклетки до формирования бластоцисты, способной имплантироваться в матку реципиента.

Перенос генов методом микроинъекции ДНК в пронуклеус зиготы. Суть метода заключается в следующем. Из яйцевода самки извлекают зиготы, освобождают их от окружающих фолликулярных клеток, инкубируют в средах Дюльбекко или Виттена под объективом микроскопа. Зиготу фиксируют микропипеткой. С противоположной стороны подводят инъекционную микропипетку, в которой находится раствор с геном. Для инъекции чужеродной ДНК в мужской пронуклеус зиготы используют плазмиды с конструкциями, промотор и структурный ген. В мужской пронуклеус инъецируют около 1 мл буферного раствора с рекомбинантной ДНК, содержащей до 100 и более копий гена. Как правило, 60−80% реконструированных зигот хорошо переносят микроманипуляции. После оценки жизнеспособности зиготы трансплантируют ложнобеременной самке-реципиенту другой генетической линии. Для подтверждения интеграции чужеродного гена от мышат, родившихся из реконструированных зигот, извлекают кусочек ткани из хвоста или печени. ДНК из ткани этих органов анализируют с помощью дот — и блот — гибридизации. В большинстве экспериментов выход трансгенных мышей, оцененных по методу дот — и блот — гибридизации, составляет 1%. Однако экспрессия чужеродного гена происходит у 5−10% полученных трансгенных мышей. Для оценки стабильности наследования чужеродных генов в процессе смены поколений методами дот — и блот — гибридизации анализируют потомство трансгенных животных.

Использование ретровирусов в качестве векторов. При переносе чужеродных генов в оплодотворенные соматические клетки животных в качестве векторов используют ретровирусы, способные внедрятся в геном эмбрионов. Ретровирусы относятся к семейству РНК-содержащих вирусов. Содержат молекулы одноцепочной линейной РНК и обратную транскриптазу (ревертазу) — фермент, с помощью которого в клетке происходит специфический синтез ДНК на РНК. В этом случае генетическая информация передается в обратном направлении от РНК к ДНК. Обратная транскриптаза в ретровирусах способна синтезировать по матрице РНК комплиментарную в ней цепь ДНК, которая служит матрицей другой комплиментарной ДНК-цепи. Вследствие этого создается двуспиральная молекула ДНК, содержащая генетическую информацию вирусной РНК. Такая ДНК интегрируется в хромосомную ДНК клетки, образуя провирус. Под провирусом понимается форма существования генома вируса, при которой этот геном объединен с генетическим материалом клетки-хозяина в единые молекулы ДНК. После интеграции репликация провируса проходит совместно с ДНК клетки хозяина, вследствие чего провирус передается дочерним клеткам. Первые результаты по интеграции ДНК аденовируса обезьян в геном мыши были получены в России в 1981 г. Впоследствии для избежания инфекционного процесса в эмбрионе стали использовать дефектный ретровирусный вектор, конструирование которого проводится на основе клонирования терминальных фрагментов длинных концевых повторов LTR, находящихся на ДНК. В этих повторах расположены регуляторные последовательности, определяющие репликацию ДНК ретровируса и экспрессию его генов. Для синтеза вирусоспецифических ферментов необходимо присутствие вируса-помощника, у которого после микрохирургии отделяют фрагмент инкапсидации. В результате развивается инфекционный процесс, который заканчивается формированием ретровирусного вектора.

Инъекция трансформированных эмбриональных стволовых клеток в эмбрион. Клеточные популяции, из которых образуются ткани — это клоны, возникшие из эмбриональных стволовых клеток или клеток-родоначальниц. Стволовые клетки способны делиться и дифференцироваться в одном или нескольких направлениях. Эмбриональные стволовые клетки получают из бластоцисты мыши. Такие клетки можно размножать, культивировать in vitro, создавать банки клеток с желательными генетическими свойствами. В выделенные клетки можно инъецировать генные конструкции.

Эмбриональные стволовые клетки следует отличать от эмбриональных тератокарциномных стволовых клеток, которые можно выделить из опухоли и культивировать in vitro. При трансплантации млекопитающих тератокарциномных клеток под кожу у животных возникают тератокарциномы. Если инъецировать тератокарциномные клетки в бластоцисту или агрегировать их с бластомерами нормального эмбриона, можно получить химерных эмбрионов. Развитие их приведет к рождению жизнеспособных химерных мышей, в органах и тканях которых обнаружатся тератокарциномные клетки. У части животных эмбриональные тератокарциномные клетки образовывали репродуктивные органы, и при скрещивании таких химер в первом поколении рождались животные, генетически тождественные животным с эмбриотератокарциноми клетками. Эмбриональные тератокарциномные стволовые клетки обозначают буквами ЕС, линии эмбриональных стволовых клеток, полученные из доимплантационных эмбрионов, называют ESклетками. Доказано, что линии ES-клеток хорошо культивируются in vitro, сохраняя при этом нормальный кариотип. Если инъецировать в бластоцисту мыши ES-клетки, длительно культивировавшиеся in vitro, то они принимают участие в развитии различных органов и тканей. В лабораторных условиях получены жизнеспособные мыши-химеры, в организме которых идентифицированы потомки линии ES-клеток, в том числе и в гонадах. Установлено, что в половых железах химерных мышей за счет потомков ESклеток в 20% случаев образуются нормальные половые клетки. С помощью эмбриональных стволовых клеток были получены трансгенные мыши. Для получения трансгенных животных необходима генетическая трансформация выделенных ES-клеток, прежде чем последует их включение в реципиентную бластоцисту.

Для проведения генетической трансформации ES-клеток используют два физических метода:

• 1. электропорацию
• 2. микроинъекцию.

Суть электропорации состоит в переносе ДНК непосредственно через клеточную мембрану с помощью высоковольтных электрических импульсов. Методом микроинъекции вводят чужеродный ген в ядра ES-клеток. Метод использования эмбриональных стволовых клеток, который на мышах признан классическим, создает неограниченные возможности в разведении сельскохозяйственных животных как в отношении трансплантации ES-клеток в бластоцисту, так и путем создания и селекции генотипов трансформированных клеточных линий в условиях культивирования in vitro.

Успешные эксперименты по получению трансгенных мышей с новыми генетическими признаками способствовали проведению подобных работ и с другими видами млекопитающих: кроликами, овцами, свиньями, крупным рогатым скотом. Технология получения трансгенных сельскохозяйственных животных имеет свои особенности. Это связано с тем, что у крупных сельскохозяйственных животных зиготы содержат значительные количества жировых и пигментных включений, что существенно затрудняет визуализацию пронуклеусов. Для лучшей визуализации требуются дополнительные микроманипуляции — центрифугирование, флуоресцентная микроскопия, что снижает жизнеспособность зигот и выход полноценных потомков. При введении сельскохозяйственным животным генов пептидов и белков можно получить их в больших масштабах. Такие гены получили название Gene farming. Теоретически возможно промотор коровьего или овечьего белка соединить со структурной частью желаемого гена, например гена инсулина, интерферона, фактора свертываемости и гормонов. Такие гены, как показали эксперименты, экспрессируются в молочной железе и выделяются с молоком. Трансгенных сельскохозяйственных животных используют для продуцирования человеческого инсулина. Экспериментально было доказано, что ген инсулина человека, введенный в геном мыши, функционирует в мышиных клетках поджелудочной железы. Другими словами, ген инсулина человека проявляет себя в организме мыши, как его собственный.

Другой проект связан с получение фактора свертываемости крови человека из молока трансгенных овец и коров. В частности, фактор свертываемости крови человека применяется в фармакологии для лечения гемофилии. Факторы свертываемости крови — дорогостоящие медицинские препараты, поэтому использование трансгенных животных в качестве «биореактора» для производства такого чистого медицинского препарата представляет большой интерес.

Получение трансгенных животных с высокой плодовитостью. Плодовитость относится к полигенным признакам. На ее формирование влияют два гонадотропных гормона ФСГ и ЛГ, которые находятся под генетическим контролем. В овцеводстве изучают, выделение, клонирование и введение в геном гена многоплодия. В настоящее время проводится изучение структуры этого гена. Резистентные трансгенные животные.

В ряде стран разрабатывается проект создания трансгенных животных, резистентных к ряду заболеваний. Однако известны немногие гены, контролирующие специфическую резистентность к возбудителям болезни. В селекции КРС планируются работы по введению генов резистентности к наследственным болезням, болезням конечностей, маститу и др.

Получение трансгенных животных с улучшенными полезно хозяйственными признаками. Улучшить качество продуктов животноводства можно путем создания трансгенных животных, в геноме которых содержится желаемый ген. Проводятся исследования по объединению регуляторной области гена белка и информационного района гена хозяйственно полезного признака. Предложена модель снижения содержания лактозы в молоке коров и овец. Нарушение синтеза лактозы приводит к наследственной болезни — галактоземии с острыми хроническими проявлениями. Предполагается, что получение трансгенных коров и овец, несущих в геноме тканеспецифический промотор и сцепленный с ним ген лактозы на глюкозу и галактозу продуцировать молоко с высокими лечебными свойствами. В Австралии — разрабатывают проект пересадки новых генов, кодирующих два фермента. Эти ферменты ответственны за синтез аминокислот — цистеина и метионина, необходимых для роста шерсти. Недостаток указанных кислот в организме овцы лимитирует рост шерсти.