Микрофлора желудочно-кишечного тракта животных

В последнее время значительно возрос интерес к индигенной (собственной) микрофлоре сельскохозяйственных и домашних животных и способам её коррекции. Вопрос овозможности существования животных и человека в отсутствии микроорганизмов впервыебыл поставлен Луи Пастером (цитируется по 10). Согласно современным представлениям, вестественной среде обитания необходим симбиоз макроорганизма с заселяющей егомикрофлорой. Безмикробные животные (и растения) могут жить и развиваться только вусловиях искусственной изоляции (стерильной окружающей среде). Нормальная микрофлора животного и человека постоянно персистирует в организмездорового хозяина и взаимодействует с ним по принципу симбиоза. Индигенная флора представлена микробиоценозами (определенными сообществамимикроорганизмов), формирующимися в естетственных нишах (биотопах) физиологическихсистем макроорганизма (пищеварительный тракт, респираторный и урогенитальныйаппараты, кожный покров и т. д.) контактирующих с внешней средой. В любоммикробиоценозе различают характерную для данного вида (облигатную, резидентную) ислучайную (факультативную, временную, транзиторную) микрофлору. В каждом из биотопов формируются собственные, отличные от других, условия длясуществования и взаимодействия населяющих их микроорганизмов. Поэтому видовой иколичественный состав флоры в разных биоценозах имеют существенные различия. В связис этим существуют такие понятия, как микроэкология кишечника, кожного покрова, гениталий, верхних дыхательных путей, полости рта и т. д. В живом организме содержится огромное количество клеток микроорганизмов-симбионтов (достигает 1014). Их видовое разнообразие (свыше 400 видов) обеспечивают участиенормальной микрофлоры в самых разнообразных физиологических функцияхмакроорганизма (13, 14). Одной из важнейших функций нормальной микрофлоры является обеспечениеколонизационной резистентности (КР) по отношению как к посторонним микроорганизмам, проникающим в организм хозяина, так и ограничение размножения ее отдельныхпредставителей вне мест свойственного им обитания. При снижении КР происходитнарушение равновесия качественного и количественного состава индигенной флоры. За счетувеличения роста отдельных популяций микроорганизмов происходит колонизацияпоследними кожного и слизистых покровов макроорганизма, а также отмечают расширение ареала распространения представителей оппортунистической (условно-патогенной) микрофлоры, включая аэробы и анаэробы, их транслокацию во внутренние органы. Этоведёт к гнойно-воспалительным процессам, септицемии. Усиливается передача факторовантибиотикорезистентности и патогенности между сообществами бактерий (1, 8, 16). Наиболее сложные микробиоценозы млекопитающих — микрофлора толстого отделакишечника, рта и носоглотки. Качественный и количественный состав микрофлорыповерхности кожи, а также слизистых полости носа, гениталий и т. д. более скуден. Поэтомуиндигенная микрофлора кишечника оказывает существенное влияние на состояниемикробиоценозов остальных биотопов живого организма. Состав нормальной флоры желудочно-кишечного тракта здоровой взрослой собаки (табл. 1) стабилен и при отсутствии существенных изменений в условиях кормления, содержания, стрессовых ситуаций, а также заболеваний с применением фармакологических препаратовколеблется незначительно. Из-за высокой кислотности микробиоценоз желудка достаточноскуден. Микроорганизмы, способные сохранять свою жизнедеятельность в кислой среде и вприсутствии пепсина (ацидофильная палочка и другие лактобактерии, энтерококки, грибы, бациллы, сарцины), локализуются преимущественно в пилорической его части. Удельноеколичество микрорганизмов двенадцатиперстной и тощей кишок колеблется в пределах 102−105 бактерий в 1 г их содержимого. Торможение их роста в этой части тонкого отделакишечника обеспечивается за счет более кислой среды, которая поддерживается за счетпоступления химуса (содержимого желудка), и выброса желчных кислот. Активнаяперистальтика, секреторные иммуноглобулины (IgA, IgЕ), и ферменты непосредственноучаствуют в регуляции численности микроорганизмов. Основные обитатели — лактобактерии, энтерококки, энтеробактерии, стептококки, по своему количественномупредставительству незначительно уступают бифидобактериям, иногда встречаются кандиды. Аналогичная ситуация наблюдается и в краниальной части подвздошной кишки, тогда как вкаудальной микробиоценоз значительно разнообразнее и часто включает в свой состав виды, преимущественно обитающие в толстом отделе кишечника (бактероиды, клостридии, эубактерии, фузобактерии и др.). Удельное содержание микроорганизмов в данном участкеможет достигать 107 в 1 г содержимого кишечника. Следует сказать, что микробиозенозиндигенной флоры толстого отдела кишечника в сравнении с тонким значительнопреобладает как в качественном так и количественном отношении. Кроме упомянутых втаблице 1, здесь практически всегда имеются представители вейолонелл, пептококков, пептострептококков, актиномицетов, псевдомонасов, алкалигенесов и других родов (11). Помере продвижения к прямой кишке удельное содержание бактерий растет (1010−1012микробных клеток в 1 г содержимого). В зависимости от влажности фекалий процентноесодержание бактериальной массы по отношению к общему весу исследуемого материалаколеблется в пределах 15−30%. В данной статье в первую очередь предлагаются результаты исследования микроэкологиикишечника у собак в возрасте 2−7 лет, где особое внимание уделяли нормальноймикрофлоре. В ближайших номерах мы планируем представить материалы по возрастной динамикеиндигенной флоры кишечника, также будут рассмотрены причины развития дисбактериозов (снижения КР) и способы их коррекции. Полученные результаты показывают, что основу нормальной микрофлоры кишечника усобак, как и у других животных, составляют неспорообразующие облигатные анаэробныемикроорганизмы. Соотношение представителей анаэробной-аэробной флоры кишечника внорме составляет примерно 1000:1 соответственно. Важнейшими представителями резидентной флоры желудочно-кишечного тракта являютсябифидои лактобактерии, бактероиды, энтерококки, эшерихии, дрожжеподобные грибы (9). БифидобактерииБольшую часть нормофлоры кишечника (от 60 до 90% и более) у здоровых собак, как и удругих моногастричных животных составляют бифидобактерии (рис. 1). В норме из 1 гсодержимого толстого отдела кишечника собак (в зависимости от возраста, типа кормленияи др.) их высевали до 1012. Следует обратить внимание ветеринарных врачей на то, что микроскопическое исследованиефекалий при использовании специальных методов окраски мазков может дать лишьориентировочное представление о соотношении основных групп популяциймикроорганизмов (присутствие кокков, грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов и т. д.). Наличие либо отсутствие бифидофлоры этим методом установить нельзя, т.к. она имеет морфологические сходства с целым рядом других бактерий — облигатныхмикроорганизмов кишечника (приложение 1). Определение количественного содержания бифидофлоры осуществляют методом посевапоследовательных десятикратных разведений исследуемого материала на элективные (специальные) полужидкие питательные среды, которые разливают высоким (не менее двухтретьих высоты пробирки) столбиком и перед посевом регенерируют (прогревают). Подвергаемый бактериологическому анализу материал вносят аккуратно в нижнюю частьпробирки, содержимое которой слегка перемешивают, соблюдая при этом условияанаэробиоза, и далее инкубируют при оптимальной температуре от 1 до 3 дней. Такого родаисследование требует высокой квалификации и практических навыков бактериолога. Учитывая доминирующее положение бифидофлоры в кишечнике здоровых особей, а такжеданные клинических и микробиологических исследований, многие авторы пришли к выводуо том, что представители рода бифидобактерий — основная таксономическая группамикрофлоры желудочно кишечного тракта, которая является показателем здоровья (4). Действительно, при снижении КР бифидофлора первой исчезает из желудочно-кишечноготракта. Преобладание же данных микроорганизмов в кишечнике, как правило, препятствуетразмножению патогенных и условно-патогенных бактерий, нормализуя микробиоценоз вцелом. Антагонистическая активность бифидобактерий к патогенам, относящимся кэнтеробактериям (эшерихии, клебсиеллы, сальмонеллы, протей, шигеллы и т. д.), коккам (срепто-, стафилококки), вибрионам, кампилобактериям, клостридиям, и другиммикроорганизмам обеспечивается за счет образования в процессе ферментации углеводовацетата и лактата, продукции летучих жирных кислот (ЛЖК), лизоцимоподобных и другихвеществ, обладающих антибактериальной активностью, а также способности подавлятьтоксиноообразование либо разрушать токсины патогенных бактерий и т. д. Особо следуетподчеркнуть их участие в симбиозе с макроорганизмом на уровне пристеночногопищеварения, что определяется хорошо выраженными адгезивными свойствами. Этоявляется одним из главных элементов конкурентоспособности в освоении пищевой ниши поотношению к другим представителям индигенной флоры и патогенам. Бифидобактерии непосредственно принимают участие в регуляции иммунных функциймакроорганизма. Они стимулируют пролиферацию клеток лимфоидной ткани, усиливаютфагоцитарную активность макрофагов, моноцитов и гранулоцитов, усиливаютспецифический гуморальный иммунитет, синтез цитокинов (выработку гамма-интерферона, JL-6, TNF, ALPHA), а также стимулируют иммунные механизмы на уровне клеток, включаяпротивоопухолевую защиту (7, 15). Как и другие представители индигенной флоры бифидобактерии способны вызыватьдеконъюгацию желчных кислот. Они также активно участвуют в водно-солевом, белковом, жировом, нуклеотидном, витаминном обменах, поддержании рН и анаэробиоза в кишечнике. Они синтезируют такие аминокислоты, как лизин, аргинин, валин, метионин, лейцин, тирозин, а также глютаминовую кислоту. На долю незаменимых аминокислот приходитсяоколо 40% от общего их количества. Внутриклеточно бифидобактерии аккумулируютвитамины В1, В2, В6, В12, С, никотиновую, фолиевую кислоты и биотин, а такжепродуцируют в культуральную среду В6, В12 и фолиевую кислоту. При дефицитепредставителей данного рода снижается синтез эндогенного образования витамина К, чтоведёт к нарушению процессов свёртывания крови. Изложенная кратко характеристика бифидобактерий свидетельствует о том, что они как однаиз разновидностей нормальной флоры макроорганизма доминируют не только вколичественном, но и в качественном (физиологическом) отношении. В проведенной нами видовой идентификации бифидобактерий, выделенных из фекалийсобак, показано, что преобладающим оказался вид B. adolescentis (41,7% штаммов), вторымпо численности был вид B. globosum (16,7%), третьим — B. termophilum (8,3%). Ни в одном изслучаев не удалось выделить от собак бифидобактерии вида B. bifidum, характерные длякишечника человека и используемые для изготовления пробиотических препаратов вгуманитарной медицине. ЛактобактерииВторой по численности, а очевидно и по значимости группой резидентной флорыжелудочно-кишечного тракта собак являются молочнокислые бактерии, представители родаLactobacterium (приложение 2). По данным наших исследований количество лактобактерий уздоровых собак составляет 106−109/г содержимого толстого отдела кишечника (рис.1). Приснижении КР (дисбактериозах) лактобактерии высеваются в значительно меньшемколичестве или их не удается обнаружить вовсе (рис. 2). Молочнокислые бактерии как облигатные представители желудочно-кишечного трактапринимают активное участие в происходящих в нем процессах. Они ферментируют большоеколичество углеводов и спиртов, отдельные представители данного рода вызывают гидролизкрахмала и синтезируют белки. Антагонистическая активность молочнокислых бактерий в отношении гнилостной, патогенной и условно-патогенной микрофлоры обусловлена их способностью синтезироватьмногочисленные антибиотические вещества. Некоторые из них относятся к низкомолекулярными белкам. Их классифицировали какбактериоцины, сходные по механизму своего действия с антибиотиками, но отличающиесяот них малой активностью в отношении близкородственных видов микроорганизмов (приложение 3). Характеристика физико-химических свойств бактериоцинов ацидофильныхбактерий позволила объединить их под термином «Лактацин В». Кроме того, лактобактериипродуцируют антимикробные вещества, получившие название лантабиотиков. Они менеечувствительны к действию амилаз и протеиназ и содержат аминокислоты, обычно неприсутствующие в бактериоцинах. Помимо бактериоцинов и лантабиотиков лактобактерии синтезируют неидентифицированные вещества, обладающие бактериоциноподобным эффектом. Этинизкомолекулярные органические соединения небелковой природы проявляют своюактивность в присутствии кислоты или перекиси водорода. Они сдерживают рост и развитиепсевдоманад, сальмонелл, шигелл, стрептококков, стафилококков, а также анаэробных бактерий, в том числе клостридий, бифидобактерий и бактероидов. Одним из важнейших продуктов метаболизма молочнокислых бактерий является перекисьводорода. Способность к ее продукции определяется генетически детерминируемымпризнаком и не зависит от основной среды и контакта с кислородом. Ингибирующий эффектперекиси водорода в кишечнике имеет более важное значение для сдерживания численностипредставителей аэробной флоры, чем действие продуцируемых ею органических кислот. Бактерицидный эффект перекиси водорода связан с ее сильным окислительным действием набактериальные клетки и разрушением основной молекулярной структуры клеточных белков. Лактобактерии играют важную роль в становлении иммунитета у новорожденных, имеющихнизкую активность клеточного и гуморального иммунитета и низкую фагоцитарнуюактивность мононуклеарных макрофагов. Усиление фагоцитарной активности макрофагов, захват и катаболизм ими антигенов наблюдают при пероральном, подкожном иинтраперитонеальном введении живых лактобактерий, супернатантов, убитых культур илифрагментов их стенок. В условиях in vitro и in vivo молочнокислые бактерии стимулируютпродукцию интерферонов и интерлейкинов (3, 7). Помимо перечисленных свойств, обеспечивающих иммуностимулирующий иантагонистический в отношении патогенов эффект, лактобактериям присущи и другиеважнейшие физиологические функции. Они активно участвуют в метаболизме углеводов, белков, липидов, нуклеиновых кислот. Им, также как и бифидобактериям, принадлежитважная роль в регуляции водно-солевого обмена, поддержании рН и анаэробиоза вкишечнике, деконьюгации желчных кислот, синтезе витаминов, аминов и другихбиологически активных соединений. Большая часть изученных нами штаммов лактобактерий, выделенных из фекалий собак, была отнесена к виду L. acidophilum (56%), вторым по численности был вид L. plantarum (16%), третьим — L. helveticum (12%). ЭшерихииЭто сапрофиты, которые в норме входят в состав резидентной флоры кишечника. Онирасполагаются беспорядочно и равномерно по всей полости кишечника, локализуютсяпреимущественно в просвете и лишь отчасти примыкают к эпителию его ворсинок. Так же, как бифидои лактобактерии, эшерихии активно участвуют в ферментативныхпроцессах в кишечнике, образуя при этом органические кислоты, витамины и другиебиологически активные вещества. В 1905 году H. Conrad установил, что в результатежизнедеятельности эшерихий в питательной среде накапливаются бактерицидные вещества, препятствующие росту других бактерий. В настоящее время известно, что эшерихиипродуцируют как in vitro, так и in vivo до 24 типов таких веществ, названных колицинами. Возможно, кишечную флору следует именовать не сапрофитной, а условнопатогенной, таккак в сравнении с другими представителями, относящимся к данной категориимикроорганизмов, она является наиболее агрессивной: эшерихии числе первых заселяюторганизм после рождения и их чаще других обнаруживают в крови животных при сниженииестественного иммунитета, например, после облучения. Так, по данным авторов (2, 5), болеечем в 50% случаев они являются причиной септицемии у облученных животных. Следуетпомнить, что огромное число эшерихий — патогены с постоянно выраженной высокойвирулентностью (приложение 4). В различных отделах кишечника здоровых собак количество эшерихий колеблется впределах от 102 до 109 колониеобразующих единиц на 1 г исследуемого материала. Собственные исследования, проведенные на здоровых собаках, показывают, что количествоэшерихий колеблется в пределах 106−109 в одном грамме фецес. БактероидыВ состав нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта, а также ротовой полости, верхних дыхательных путей, мочеполовых органов, входят бактероиды. Род Bacteroides включает более 20 видов, большинство из которых выделяется из организма человека иживотных. В условиях кислой среды бактероиды проявляют антагонистическую активность поотношению к сальмонеллам, эшерихиям, другим микроорганизмам и, по-видимому, играютсущественную роль в резистентности организма к инфекциям. Однако результатыисследований последних лет свидетельствуют об их участии в этиологии многихпатологических процессов: энтеритов, некротических гепатитов, перитонитов, менингитов ит. д. Изучение патогенности представителей данного рода на животных свидетельствует обих синергизме в развитии инфекционных процессов, который отмечают в отношенииборрелий, микоплазм, стрептококков, стафилококков, пастерелл, а у человека — холерноговибриона (6). В 1 г содержимого толстого отдела кишечника здоровых собак их количество колеблется впределах 107−1010. ЭнтерококкиШироко распространены в природе фекальные стрептококки или энтерококки. Ихобнаруживают в кишечнике и фекалиях человека и животных, а также в почве и воде. Энтерококки являются облигатными представителями нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта и некоторые из них (главным образом Ent. faecium) включают в составпробиотических препаратов для нормализации кишечной микрофлоры. Антагонистическиефункции этих микроорганизмов связаны, главным образом, с их кислотообразующимисвойствами и способностью продуцировать бактериоцины. В тоже время энтерококки — это факультативно-анаэробные условно-патогенныемикроорганизмы, способные вызывать у животных и человека гастроэнтериты, пневмонии, маститы, эндокардиты, менингиты, септицемию и другие заболевания. Как и свойственновсем условно-патогенным микроорганизмам, их отрицательное воздействие проявляется уособей со снижением общей резистентности. Содержание представителей данного рода микроорганизмов у здоровых собак составляет104−108/ г фекалий (собственные исследования). Клостридии В организме животных и человека обнаруживается до 35 видов клостридий. Количественныйпоказатель отдельных видов (Cl.clostridiforme, Cl. innocuum, Cl. ramosum) может достигать108−109/г фекалий (11). По данным собственных исследований, частота выделения клостридий из кишечника собакколебалась в пределах 75−100% случаев. Их удельное содержание в различных отделахсоставляло от 0 до 104 /г исследуемого материала. Характерной особенностью клостридий является их способность к сапрофитномусуществованию в почве и желудочно-кишечном тракте человека и животных. Рольпредставителей данного рода для макроорганизма (исключая патогенные виды) изученанедостаточно. Имеются данные литературы, свидетельствующие о синтезе клостридиямивитаминов: никотиновой, фолиевой, пантотеновой кислот и рибофлавина (12). Поэтомуестественно предполагать, что клостридии также участвуют в поддержании кишечногонормобиоза своего хозяина. Более того, некоторые авторы считают, что клостридии, вособенности тех видов, количество которых может достигать больших величин, являютсянаиболее древней регуляторной системой микроэкологии человека и животных, обеспечивающей гомеостатические взаимоотношения между хозяином и его микрофлорой. Грибы рода Candida Дрожжеподобные грибы рода Candida составляют самостоятельный род и насчитываютболее 80 видов. Они входят в состав нормальной флоры, заселяющей слизистые оболочкиреспираторного аппарата и желудочно-кишечного тракта, а также половых органов и кожи. Из фекалий здоровых собак мы высевали их в количествах до 103, редко — 104/г. Грибы родаCandida также относятся к условно-патогенным микроорганизмам, и все факторы, снижающие общую или колонизационную резистентность макроорганизма и угнетающиенеспецифическую иммунную защиту, создают условия для активизации их роста и развитияспецифического заболевания — кандидамикоза. В экспериментах на обезьянах и собакахпоказано, что эти микроорганизмы могут проникать в организм хозяина через слизистыеоболочки кишечного тракта и поступать в кровь. Существенное значение в патогенезезаболевания имеет эндотоксин, вызывающий поражение паренхиматозных органов. Перечисленные выше группы микроорганизмов составляют основную часть более или менееизученной для желудочно-кишечного тракта животных резидентной микрофлоры. При этомследует отметить тот факт, что только бифидои лактобактерии являютсямикроорганизмами, участие которых в патологических процессах (как прямое, так икосвенное) на сегодняшний день не установлено. Кроме резидентной микрофлоры в желудочно-кишечном тракте спорадически встречаются идругие микроорганизмы, именуемые транзиторными, которые чаще всего высеваются призаболеваниях желудочно-кишечного тракта животных, хотя и среди них встречаютсясапрофитные виды микробов. В первую очередь это клебсиеллы, псевдомонасы, протей, стафилококки, спирохеты, цитробактеры, энтеробактеры, плесневые грибы и другие. На количественное разнообразие резидентной микрофлоры собак, на численноесоотношение в микробиоценозе того или иного биотопа резидентной и транзиторноймикрофлоры основное влияние оказывают возраст, тип кормления и различные факторывнешней среды, включая применение лекарственных препаратов. Пока в микробиоценозахпреобладают представители нормальной микрофлоры, сохраняется КР и здоровьемакроорганизма в целом. Если же внешние воздействия (химиотерапевтические препараты, пестициды и другие яды, стрессы, вирулентные микроорганизмы и т. д.) по своейинтенсивности превышают компенсаторные механизмы экологической системы"макроорганизм — его нормальная микрофлора", то в микробиоценозах начинаетпреобладать транзиторная микрофлора, что ведет к развитию локальных инфекционныхпроцессов, либо даже генерализованной инфекции и другим осложнениям. Таким образом, очевидно, что животный организм и населяющая его микрофлора являютсявзаимозависимыми и сосуществующими частями единой системы. С экологических позицийвзаимодействие между макрои микроорганизмами является частным случаем универсальнораспространенного в живом мире симбиоза с его различными формами (комменсализм, мутуализм, паразитизм, хищничество и т. п.). Исходя из выше сказанного следует, что взаимодействие между нормальной микрофлорой иорганизмом хозяина преимущественно осуществляется на уровне мутуализма. Микроорганизмы кишечника, являясь частью нормофлоры, одновременно представляютсобой сложную саморегулирующуюся открытую систему, где их различные популяцииимеют многообразные взаимоотношения как на уровне их сообществ, так и с организмомхозяина. Наиболее заметную роль играют их конкурентно-антагонистические свойства, что, в основном, и определяет нормальное функционирование единой экологической системы: животный организм — окружающая его среда.