15г. 
Определение общего иммуноглобулина класса E (IgE)

Клиническое значение.

Общий иммуноглобулин Е (IgE) считается лабораторным маркером атопических заболеваний (атопической астмы, дерматита и риноконъюнктивита). Атопический (IgE-зависимый) механизм может также лежать в основе гастроэнтероколита, крапивницы, других форм васкулитов (в том числе системных), холецистита, вульвовагинита и цистита. Часть лекарственной аллергии (преимущественно на пенициллины и белковые препараты) также развивается по IgE-зависимому механизму. При всех вышеперечисленных состояниях выработка высоких титров специфических антител класса IgE может приводить к повышению уровня общего IgE в сыворотке. Особенно высокий уровень общего IgE характерен для атопического дерматита. Кроме атопических заболеваний, общий IgE сыворотки крови значительно повышается при паразитарных инвазиях и микозах (особенно системных), редко — при системных аутоиммунных заболеваниях и иммунодефицитных состояниях (особенно при гипер-IgE синдроме). Снижение уровня общего IgE в сыворотке (ниже 15 МЕ/мл у взрослых) — явление редкое и малоизученное, описано при гипогаммаглобулинемиях, некоторых аутоиммунных заболеваниях, язвенном колите и первичном билиарном циррозе.

Принцип работы набора.

Определение общего иммуноглобулина класса E (IgE) основано на использовании «сэндвич"-варианта твердофазного иммуноферментного анализа. На внутренней поверхности лунок планшета иммобилизованы мышиные моноклональные антитела к общему IgE человека. В лунках планшета, при добавлении исследуемого образца, происходит связывание общего IgE, содержащегося в исследуемом образце, с антителами на твердой фазе. Образовавшийся комплекс выявляют с помощью конъюгата кроличьих поликлональных антител к IgE человека с пероксидазой хрена. В результате образуется связанный с пластиком «сэндвич», содержащий пероксидазу. Во время инкубации с раствором субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) происходит окрашивание растворов в лунках. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации общего иммуноглобулина класса E (IgE) в исследуемом образце. Концентрацию общего иммуноглобулина класса E (IgE) в исследуемых образцах определяют по калибровочному графику зависимости оптической плотности от содержания общего иммуноглобулина класса E (IgE) в калибровочных пробах.

Проведение анализа.

• 1. Поместите в рамку необходимое количество стрипов — исследуемые образцы в 2 повторах и 12 лунок для калибровочных.
• 2. Внесите во все лунки планшета по 50 мкл ИФА буфера.
• 3. Внесите в соответствующие лунки в дубликатах по 50 мкл калибровочной пробы и контроль-ной сыворотки. В остальные лунки внесите в дубликатах по 50 мкл исследуемых образцов cыворотки (плазмы) крови. Внесение калибровочных проб, контрольной сыворотки и исследуемых образцов необходимо произвести в течение 5−10 минут
• 4. Аккуратно перемешайте содержимое планшета круговыми движениями по горизонтальной поверхности, заклейте планшет бумагой для заклеивания планшета. Инкубируйте планшет в течение 30 минут при температуре +37 °C.
• 5. По окончании инкубации удалите содержимое лунок аспирацией (например, с помощью водоструйного насоса) или декантированием и отмойте лунки 3 раза. При каждой отмывке добавьте во все лунки по 250 мкл отмывочного раствора, встряхните планшет круговыми движениями по горизонтальной поверхности с последующей аспирацией или декантированием. Задержка при отмывке (замачивание лунок) не требуется. При каждом декантировании необходимо тщательно удалять остатки жидкости из лунок.
• 6. Внесите во все лунки по 100 мкл конъюгата.
• 7. Заклейте планшет бумагой для заклеивания планшета и инкубируйте его в

течение 30 минут при температуре +37 °C.

• 8. По окончании инкубации удалите содержимое лунок и отмойте лунки 5 раз.
• 9. Внесите во все лунки по 100 мкл раствора субстрата тетраметилбензидина. Внесение раствора субстрата тетраметилбензидина в лунки необходимо произвести в течение 2−3 мин. Инкубируйте планшет в темноте при комнатной температуре (+18…+25 °С) в течение 10−20 минут в зависимости от степени развития синего окрашивания.
• 10. Внесите во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор субстрата тетраметилбензидина, по 100 мкл стоп-реагента, при этом содержимое лунок окрашивается в ярко-желтый цвет.
• 11. Измерьте величину оптической плотности (ОП) содержимого лунок планшета на фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм. Измерение ОП содержимого лунок планшета необходимо произвести в течение 15 мин после внесения стоп-реагента. Бланк фотометра выставляйте по воздуху.
• 12. Постройте в линейных координатах калибровочный график: ось абсцисс (х) — концентрация общего IgE в калибровочных пробах (МЕ/мл), ось ординат (у) — оптическая плотность калибровочных проб (ОП 450 нм). Для алгоритма обсчета (аппроксимации) калибровочного графика используйте интервальный (кусочно-линейный, «от точки к точке») метод.
• 13. Определите по калибровочному графику содержание общего IgE в исследуемых образцах.