Анализ внутриклеточного содержания HSP70 методом Вестерн-блоттинга

Нейтрофилы в количестве 2−5 млн лизировали буфером, содержащим 20 мМ Трис-HCl (pH7.5), 150 мМ NaCl, 1 мМ Na2EDTA, 1% тритон X-100 и смесь ингибиторов протеаз в объеме 100 мкл в течение 5 мин на льду. После центрифугирования при 10 000 g в течение 10 мин отбирали надосадок и проводили измерение концентрации тотального белка в лизированных образцах нейтрофилов с использованием реагента Брэдфорда. Фракционирование белков проводили в условиях денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле с концентрацией разрешающего геля 10%. Общее количество белка, вносимого в лунку, в каждом образце было выравнено и составляло в среднем 50 мкг/лунку. После процедуры переноса на нитроцеллюлозную мембрану, проводили блокирование мембраны в буфере T-TBS (20 мМ Трис-HCl (pH7.6), 138 мМ NaCl, 0.1% Tween 20) c 5% содержанием обезжиренного сухого молока с последующей отмывкой в T-TBS. Затем мембрану окрашивали моноклональными антителами против HSP70 (BRM22) и в-актина (AC-15), разведенных в TTBS с 5% BSA в течение 12 ч при 4 °C с последующей двукратной отмывкой, а затем антителами против Ig мыши, меченных пероксидазой хрена. Иммуноблот проявляли, используя субстрат, содержащий диаминобензидин и перекись водорода (0.003%). Результат фиксировали с помощью системы гель-документации (Vilber Lourmat, Франция). Анализ блотов проводили в программе обработки денситомтерических даных ImageJ 1.38х (Wayne Rasband, NIH, США).