Анализ биохимических показателей

Экстракция белков из тканей.

У лабораторных животных (крыс) для последующего биохимического анализа были взяты образцы нервной ткани — гиппокампа и коры больших полушарий. Учитывая дисперсность пула кальпаинов в клетке, связанную со спецификой их регуляции, определяли показатели как в цитозольной фракции клеток, так и во фракции мембрано-связанных белков, полученных по методу (Enns, Belcastro, 2006). Цитоплазматическую фракцию получали из ткани, гомогенизированной в 20 мМ Трис-HCl-буфере (рН 7.5) с добавлением 80 мМ КСl, 5 мМ Na-соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) и 20 мМ дитиотреитола (DTT) (соотношение 1:10, вес/объем) с последующим центрифугированием (20 000 g, 20 мин). Фракцию мембраносвязанных белков — повторным центрифугированием (20 000 g, 20 мин) получившегося осадка, предварительно ресуспендированного в равном объеме того же буфера с добавлением 0.33% тритона X-100. Буфер для гомогенизации включал смесь ингибиторов протеиназ: лейпептина (0.5 мкг/мл), пепстатина (1 мкг/мл), апротинина (1 мкг/мл) и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF).

Буфер для гомогенизации, (объём 500 мл).

• * 20 мМ Трис, навеска 1,2114 г
• * 80 мМ хлорида натрия, навеска 2,98 г
• * 5 мМ ЭДТА, навеска равна 0,9306 г
• * 20 мМ ДТТ, навеска равна 1,54 г
• * растворить в дистиллированной воде, довести рН до 7,5 5 конц. HCl
• * довести водой до 500 мл в колбе

Буфер для гомогенизации с тритоном Х-100 (объём 100 мл).

• * 0,33% тритон Х-100, навеска 0,33 г.
• * довести до 100 мл буфером для гомогенизации.

Ингибитор PMSF (объем 10 мл).

• * 100 мМ PMSF, навеска 174 мг
• * растворить в 10 мл изопропанола
• * разлить по аликвотам 0,5 мл, заморозить при -20 С

Определение активности кальпаинов.

В полученных фракциях цитозольных и мембраносвязанных белков оценивали активность кальпаинов — Са2±зависимую казеинолитическую активность, чувствительную к ингибиторам цистеиновых протеиназ (Enns, Belcastro, 2006). Реакционная смесь, объемом 500 мкл, включала 0.5 мг казеина, денатурированного щелочью, 20 мМ DTT, 200 мкл ферментной фракции и 2.5 мМ СаСl2 или EDTA (для оценки Са2±зависимой и Са2±независимой активности, соответственно) в 50 мМ Трис-HCl-буфере (рН 7.5). После 30-минутной инкубации (28°С) в аликвотах 100 мкл спектрофотометрически определяли содержание остаточного белка по методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Единицу активности кальпаинов (ед.акт.) определяли как количество фермента, вызывающее увеличение оптического поглощения на 0.1 OE при 595 нм за 1 ч реакции в указанных условиях. Удельную активность определяли в расчете на 1 мг белка соответствующей фракции.

• 1. Буфер для реакции (объём 500 мл)
• * 20 мМ ДТТ, навеска 1.55 г
• * 70 мМ Трис, навеска 4,235 г
• * прилить дистиллированной воды, довести рН до 7,5 конц. HCl
• * довести дистиллированной водой до 500 мл
• 2. На буфере для реакции — 0,1 М раствор хлорида кальция (объём 100 мл)
• * хлорид кальция, навеска 1,47 г
• * довести до 100 мл буфером для реакции
• 3. На буфере для реакции 0,1 М раствор ЭДТА (объём 100 мл)
• * ЭДТА, навеска 3,72 г
• * довести до 100 мл буфером для реакции

Зимография с козеином.

Характеризацию пула кальпаинов проводили также методом зимографии с казеином согласно методу (Arthur, Mykles, 2000). Общую фракцию цитоплазматических и мембраносвязанных белков получали центрифугированием тканевых гомогенатов (105 000 g, 30 мин) в 50 мМ HEPES-NaOH-буфере (рН 7.6), содержащем 150 мМ NaCl, 10% глицерин, 0.1% тритон Х-100, 5 мМ EDTA, 10 мМ 2-меркаптоэтанола и ингибиторы протеиназ (0.1 мМ PMSF, 10 мкг/мл лейпептин) (соотношение 1:10, вес/объем). Разделяли белки (30 мкг на дорожку) в 12% ПААГ, сополимеризованном с казеином («Bio-Rad», США) в концентрации 0.2%. Этап нативного электрофореза сопровождался инкубацией геля в 50 мМ Трис-HCl-буфере (рН 7.2), содержащем 10 мМ меркаптоэтанола и 5.0 мМ СаCl2, и его стандартной окраской Coomassie brilliant blue R-250.

Реактивы для зимографии:

• 1. Раствор казеина:
• 10 мг/мл казеина в 0,75 М Трис-HCl-буфере, рН=8,8 (50%-ный буфер А).
• 2. Буфер для инкубации с кальцием (объем 1 л):
  • · 50 мМ Трис-HCl-буфер, навеска 6,057 г, рН = 7−7,2 при комнатной температуре
  • · 5 мМ хлорид кальция, навеска 0,735 г
  • · 10 мМ ДТТ, навеска 1,54 г
  • · Довести объем в колбе до 1 л б/д водой

Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле — метод разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью, детерминированной длиной полипептидной цепочки, молекулярной массой, укладкой белковой молекулы, посттрансляционными модификациями и другими факторами. Данный способ фракционирования белков и пептидов широко применяют в современной молекулярной биологии, биохимии, генетике.

Разработано большое количество модификаций электрофореза белков в полиакриламидном геле для решения разных задач и для различных белков и пептидов. Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) по Лэммли (Laemmli, 1970).

• 1. 30% раствор акриламида (акриламид: бисакриламид =74,1: 1) (объем 100 мл)
• · 29,6 г акриламида;
• · 0,4 г бис-акриламида;
• · растворить в 100 мл б/д воды;
• · профильтровать; хранить в тёмном месте.
• 2. Буфер А: 1,5 М трис-HCl-буфер, рH =8,8 (объем 200 мл)
• · 36,312 г трис на 200 мл б/д воды
• 3. Буфер В: 0,5 М Трис-НCl-буфер, pH= 6,8 (объем 200 мл)
• · 12,114 г трис на 200 мл б/д воды
• · рН довести концентрированной HCl до нужного рН
• 4. 50% SLB-буфер:
  • · 20% глицерин, берём для приготовления 25 мл глицерина
  • · 25 мл 0,1 М Трис-HCl, рН=6,8
  • · 10 мМ ЭДТА, навеска 0,47 г
  • · 10 мМ 2-меркаптоэтанола, берём для приготовления 100 мкл
  • · 0,02% бромфенолового синего, навеска 0,03 г
• 5. Буфер для электрофореза (5-кратный), рН = 8. Не требует подведения рН (объем 1 л):
  • · 125 мМ Трис, навеска 15,14 г
  • · 626 мМ глицерина, навеска 46,92 г
  • · 5 мМ ЭДТА, навеска 1,86 г.
  • · Непосредственно перед использованием разбавить до однократного, добавить 10 мМ 2-МЭ (или 1 мМ ДТТ), для этого к 200 мл 5х-буфера прилить 800 мл б/д воды и добавить 0,8 мл 2-МЭ
• 6. Фиксаж:
  • · 45% этанол
  • · 45% вода
  • · 10% уксусная кислота
• 7. Окраска:
  • · 0,5% кумасси
  • · 10% уксусная кислота
  • · 40% этанол
  • · 50% вода
• 8. Отмывка:
  • · 10% уксусная кислота
• 9. Лизирующий буфер (для гомогенизации) (объём 200 мл)
• · 50 мМ HEPES, навеска 2,384 г, pH 7,6 (довести конц. щёлочью)
• · 150 мМ хлорид натрия, навеска 1,77 г
• · 10% глицерин, объём 20 мл
• · 0,1% Тритон Х-100, объём 0,2 мл
• · 5 мМ ЭДТА, навеска 0,3724 г.
• · 10 мМ ДТТ, навеска 0,308 г.

Вестерн-блот анализ.

Вестерн-блот анализ по тестированию количества кальпастатина включал разделение тканевых белков (30 мкг на дорожку) методом электрофореза в 12% ПААГ в присутствии SDS (Laemmli, 1970) с последующим полусухим переносом полипептидов на нитроцеллюлозную мембрану (буфер: 48 мМ Трис-HCl, 39 мМ глицин, 0.0375% SDS, 20% метанол, pH 9.2). После инкубации (2 ч, 20°C) мембраны в буфере TBS (50 мМ Трис-HCl-буфер, 150 мМ NaCl, pH 7.5) проводили блокировку сайтов неспецифического связывания 5% раствором обезжиренного молока в буфере TBST (TBS с добавлением 0.1% Tween 20, pH 7.5) в течение 1 ч. Далее мембрану подвергали последовательному экспонированию с поликлональными антителами к кальпастатину (разведение 1: 2500 в буфере TBST; 1 ч) и с антителами к IgG кролика, конъюгированными с пероксидазой (разведение1: 2000 в буфере TBST; 1 ч); каждый из указанных этапов завершался многократной отмывкой буфером TBST. Мембрану подвергали стандартной обработке системой Immune-Star (Bio-Rad, США).

Другие методы.

Концентрацию белка во фракциях определяли методом Брэдфорд (Bradford, 1976) с использованием бычьего сывороточного альбумина (BSA) в качестве стандарта.

Денситометрия полос на зимограммах и рентгеновской пленке проводилась с помощью стандартной программы «Image J».

Статистическую обработку данных проводили с применением общепринятых методов вариационной статистики с использованием пакетов программ MS Excel и StatGraphics. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия U (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни), а также с использованием однофакторного дисперсионного анализа (Коросов, Горбач, 2007).