Апробация микросателлитных ДНК-маркеров для идентификации клоновых форм сортов яблони

В классических селекционных экспериментах исследователю для изучения интересующего гена приходится по большей части работать над его фенотипическими проявлениями, представляющими собой конкретный признак. Но морфологические признаки могут иметь сложный характер наследования и часто зависят от условий внешней среды и их информативность как генетических маркеров ограничена.

Развитие методов молекулярной генетики привело к появлению нового класса генетических маркеров — ДНК-маркеров, основанных на полиморфизме первичной структуры ДНК.

Возможность их идентификации не зависит от условий окружающей среды, они не являются тканеспецифичными и, главное, с использованием ДНК — маркеров, гены, интересующие селекционера, могут быть идентифицированы на любом этапе вегетации без проведения фенотипической оценки. Кроме идентификации целевых генов, ДНК-маркеры могут быть эффективно использованы для определения уровня генетического сходства исследуемых образцов за счет анализа их геномного полиморфизма.

ДНК — маркеры генетических систем разного уровня должны обладать определенными свойствами и отвечать следующим требованиям: высокий уровень полиморфизма, кодоминантный характер наследования, оптимальный уровень частоты встречаемости в геноме для решения конкретных задач, равномерное распределение в геноме по хромосомам, селективно нейтральное поведение, упрощенная оценка параметров маркера, возможность автоматизации оценки параметров маркера, высокая воспроизводимость оценки параметров маркера, возможность легкого обмена данными между лабораториями [1].

Многочисленными исследованиями было показано, что одна из наиболее информативных систем молекулярного маркирования сельскохозяйственных культур — так называемые микросателлитные последовательности ДНК (SSR). В геномы эукариот встроены тандемные повторы из простых последовательностей, которые могут состоять из 4, 3, 2 и даже одного нуклеотида. Позже эти регионы были названы «микросателлитами» [2].

Микросателлитные последовательности распространены повсеместно в ДНК высших растений. Они были обнаружены у 34 видов. Средняя частота встречаемости на ДНК — каждые 50 тысяч пар нуклеотидов. Обследование баз данных для 54 видов растений показало, что среди SSR последовательностей в геноме ядра преобладают ди-, трии тетрануклеотидные повторы [3]. Источник полиморфизма этих последовательностей — в сайт-специфическом варьировании длины повтора, что в свою очередь обусловлено различием в числе единиц повтора [4].

Одна из наиболее крупных работ по идентификации и секвенированию SSR-локусов у яблони была выполнена Liebhard R. с соавторами (2002). Ее результатом стали 140 впервые идентифицированных микросателлитных локусов и праймерные пары, их фланкирующие. Для яблони построены детальные молекулярно — генетические карты с использованием SSR, ДНК — маркеров [5]. молекулярный маркирование селекционный клоновый Данная маркерная система на настоящий момент одна из наиболее широко используемых в исследованиях, направленных на оценку внутривидового генетического полиморфизма данной культуры. Так, к примеру, исследователи провели оценку степени генетического родства и ДНК — фингерпринт в выборке из 41 сорта яблони с использованием SSR ДНК-маркерной системы [6]. В результате работы все сорта были идентифицированы по уникальным аллельным комбинациям.

В качестве одного из наиболее крупных проектов в области изучения микросателлитного полиморфизма следует отметить исследования группы ученых из Национального центра сохранения генетических ресурсов Государственного департамента США по сельскому хозяйству (USDA-ARS-National Center for Genetic Resources Preservation). С использованием анализа полиморфизма микросателлитных локусов ядерного генома, а также полиморфных маркеров хлоропластного генома выполнили оценку уровня генетического разнообразия коллекции образцов диких видов груши, собранных в Европе и на Ближнем востоке, а также коллекции сортов и видов яблони (порядка 1900 образцов) [7−8]. По результатам исследований был выявлен ряд дубликатных образцов, а данные генотипирования послужили основой для формирования базы данных геномных фингерпринтов.

В связи с высоким уровнем полиморфизма данного вида ДНКмаркерных систем, нами была поставлена задача апробации микросателлитных ДНК-маркеров для идентификации клоновых форм от исходных сортов яблони. Актуальность исследований обусловлена также и тем, что наличие методов ускоренной ДНК-маркерной идентификации генетических различий между исходным сортом и его клоновыми формами позволит повысить эффективность клоновой селекции за счет возможности проведения отбора форм на ранних этапах селекционного процесса.