Смерть. 
Виды смерти. 
Посмертные признаки. 
Значение для врачебной практики. 
Методы патологоанатомического исследования

Смерть (биологическая) — необратимое прекращение жизнедеятельности организма, начало аутолитических процессов.

Виды смерти.

1) В зависимости от причин:

насильственная.

ненасильственная Насильственной принято считать смерть, наступившую в результате действия на организм человека внешнего фактора: механического, химического, физического и др.

Насильственная смерть может быть убийством, самоубийством или несчастным случаем, это называют родом насильственной смерти.

Выделяют следующие виды насильственной смерти:

от механических повреждений;

от механической асфиксии;

от отравления;

от действия высокой и низкой температур;

от действия электричества;

от действия изменения барометрического давления;

Ненасильственная смерть вызывается заболеваниями и реже глубокими возрастными изменениями (от старости). В некоторых случаях действие внешних и внутренних факторов происходит совместно, при этом бывает трудно определить, какой из них играет ведущую роль.

Среди возможных вариантов ненасильственной смерти выделяют понятие скоропостижной. К скоропостижной относят смерть человека, которая наступила неожиданно для окружающих на фоне кажущегося здоровья. Вид смерти определяют по характеру фактора, который привел человека к смерти. При этом факторы группируют по механизму их действия и иным признакам.

Ненасильственную смерть подразделяют на следующие основные виды:

от заболеваний сердечнососудистой системы;

от заболеваний органов дыхания;

от заболеваний центральной нервной системы;

от заболеваний органов пищеварения и другие.

2) В зависимости от развития обратимых и необратимых изменений жизнедеятельности организма:

клиническая биологическая С прекращением дыхания и сердечной деятельности наступает состояние клинической смерти. На этом этапе организм как целое уже не живет и представляет переходное положение между жизнью и смертью, наиболее глубокое угнетение центральной нервной системы. При отсутствии внешних признаков жизни в тканях организма на минимальном уровне сохраняются обменные процессы.

Термин «клиническая смерть» неправильный, смерть — состояние необратимое, а клиническая смерть — обратимое состояние, это не смерть, а глубокое угнетение жизненных функций организма, и это имело большое значение для медицины и привело к возникновению новой медицинской науки реаниматологии — науки об оживлении организма.

Продолжительность клинической смерти 5−6 минут, при охлаждении продолжительность клинической смерти может быть до 30 минут и определяется временем выживания центральной нервной системы (коры головного мозга), дольше сохраняется деятельность подкорковых центров и спинного мозга.

Период клинической смерти сменяется периодом биологической смерти и характеризуется необратимыми изменениями в коре головного мозга — «смерть мозга» (полное отсутствие сознания, устойчивое отсутствие самостоятельного дыхания, исчезновение рефлексов). Этот момент, когда нарушается интегрирующая деятельность центральной нервной системы, и следует считать началом биологической смерти. Восстановить и поддерживать искусственно деятельность кровообращения и дыхания при прекращении деятельности центральной нервной системы возможно. Восстановить же деятельность центральной нервной системы при необратимом прекращении деятельности сердца нельзя.

Диагноз смерти мозга имеет значение для трансплантации органов. После ее констатации возможно изъятие органов для пересадки реципиентам.

По существующему в большинстве стран законодательству «смерть мозга» приравнивается к биологической.

Признаки смерти Недостоверные (ориентирующие) неподвижное положение тела, бледность кожных покровов, отсутствие дыхания, отсутствие пульса и сердцебиений, отсутствие чувствительности на болевые и обонятельные раздражения, отсутствие реакции зрачков на свет, отсутствие роговичного рефлекса.

Достоверные признаки смерти:

падение температуры тела до 20⁰ С, в прямой кишке до 23⁰ С, признаки высыхания роговицы и белочной оболочки глаза (пятна Лярше),.

изменение формы зрачка на овальную форму при сдавлении глаза — феномен «кошачьего зрачка» (признак Белоглазова),.

ранние трупные изменения (охлаждение, трупные пятна, трупное окоченение, трупное высыхание, аутолиз). Развитие поздних или трансформация трупных изменений (гниение, мумификация, жировоск, торфяное дубление).

Вскрытие трупа Вскрытие трупа (синоним: секция, аутопсия) — исследование тела умершего с целью выяснения характера имеющихся изменений и установления причины смерти. Различают патологоанатомическое и судебно-медицинское вскрытие трупа.

Патологоанатомическое вскрытие трупа — исследование трупов лиц, умерших от различных болезней в больничных учреждениях.

Метод Абрикосова (А.И. Абрикосов, 1875−1955, сов. патологоанатом) — метод вскрытия трупа, при котором органы извлекаются комплексами, составляющими анатомо-физиологические системы (комплекс органов шеи и грудной клетки; печень, желудок и двенадцатиперстная кишка; почки и мочевые пути и половые органы; головной и спинной мозг).

Разрез по Лешке — это воротниковый разрез с последующим вскрытием диафрагмы. Применяется, когда необходимо сохранить лицо.

Метод Фишера — (В. Fischer-Wasels, 1877−1941, нем. патолог) 1) метод вскрытия трупа, при котором с целью сохранения целости кожи передней поверхности шеи секционный разрез проводят сбоку от сосцевидных отростков наискось до рукоятки грудины; 2) метод вскрытия головного мозга, заключающийся в его рассечении параллельными разрезами во фронтальной плоскости.

Способ вскрытия Шора — (Г.В. Шор, 1872−1948, сов. патологоанатом; син. метод полной эвисцерации) способ вскрытия трупа, при котором внутренние органы извлекают единым комплексом.

Методы исследования в патологической анатомии.

Патологическая анатомия использует три основных метода исследования:

вскрытие трупов людей, умерших от болезней;

микроскопические методы изучения тканей;

эксперимент, позволяющий моделировать на животных патологические процессы и болезни.

Каждый из этих методов имеет множество методик, которые в совокупности позволяют наблюдать патологические процессы не только на уровне организма, но и на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях. Благодаря этим методам патолог может наблюдать единство структуры и функции и в физиологических условиях, и в условиях патологии, что качественно отличает современную патологию от патологической анатомии и патологической физиологии даже первой половины XX в.

Аутопсия Вскрытие трупов (аутопсия) — один из наиболее старых методов морфологического исследования. С древних времён вскрытие (сначала отдельных органов, а затем и трупов) использовали для определения причин болезней и выявления тех изменений органов и тканей, которые возникают при заболевании и приводят больного к смерти. Именно вскрытие трупов умерших позволяет говорить о том, что представляет собой болезнь, какой морфологический субстрат соответствует нарушениям функций и клиническим проявлениям болезни в ее динамике, при выздоровлении, инвалидизации или смерти больного. По изменениям органов и тканей, обнаруженным при вскрытии, можно судить об эффективности тех или иных лечебных мероприятий, об индуцированном патоморфозе болезней, а также о врачебных ошибках и ятрогениях. Нередко лишь на вскрытии возникают подозрения на то или иное инфекционное заболевание, что позволяет провести соответствующие исследования совместно с инфекционистами, эпидемиологами, фтизиатрами и другими специалистами. Иногда во время вскрытия трупа обнаруживаются погрешности в оперативном вмешательстве или в проведённых манипуляциях, а также криминальные причины смерти. Наконец, именно результаты вскрытия, тщательное исследование всех изменений органов и систем умершего позволяют составить наиболее полное и объективное представление о том заболевании, которым страдал больной при жизни. Поэтому вскрытие обязательно предусматривает составление патологоанатомического диагноза, который строится по тем же принципам, что и клинический диагноз. Это позволяет сравнивать клинический и патологоанатомический диагнозы, констатировать их совпадение или расхождение и в последнем случае оценивать значение врачебной ошибки и искать вместе с клиницистами её причину. Тем самым вскрытие трупов умерших служит целям контроля лечебно-диагностической деятельности больницы или поликлиники и повышения квалификации врачебного персонала.

Вместе с тем результаты аутопсии, зафиксированные в протоколе вскрытия, позволяют проводить анализ ведения больного в клинике в тех случаях, когда речь может идти о врачебных преступлениях, дают возможность вести научные исследования и разрабатывать статистические данные. По результатам патологоанатомических исследований медицинская статистика анализирует причины и характер смертности населения.

В связи с указанным аутопсия не теряет своего значения и при широком использовании биопсийной диагностики заболеваний. Только вскрытие трупа позволяет увидеть и оценить всю историю болезни человека от начала и до конца, вместе с клиницистами проанализировать все этапы лечения больного, суммировать как положительный, так и отрицательный опыт врачей и обсудить все аспекты лечения и ошибок на клинико-анатомических конференциях лечебных учреждений.

Патологоанатомические вскрытия трупов производит врач-прозектор в патологоанатомическом отделении больницы. Иногда прозекторов называют патологоанатомами. Здесь нет принципиальных различий, но патологоанатомами официально являются преподаватели кафедр патологической анатомии и сотрудники соответствующих подразделений научно-исследовательских институтов. В управлениях и комитетах здравоохранения городского уровня, а также в министерствах здравоохранения областного, краевого и республиканского уровней имеется патологоанатомическая служба и должность главного патологоанатома.

Результаты аутопсии во многом зависят от метода вскрытия трупа. Существует несколько методов, которые использует патологоанатом в зависимости от конкретной ситуации и условий, в которых производится аутопсия. Одним из первых специальный метод вскрытия предложил Рудольф фон Вирхов, извлекавший органы по отдельности. При этом, однако, нарушаются анатомические связи между органами, что в ряде случаев может привести прозектора к ошибке. Позднее А. И. Абрикосов предложил вести вскрытие, следуя топографическому расположению органов, которые при этом делятся на пять систем и извлекаются в пять приёмов. Недостатком метода является то, что он приводит к расчленению анатомо-физиологических систем на фрагменты. Иногда при этом приходится рассекать опухоль или оперированные органы. Наибольшее распространение в практике получил способ Г. В. Шора, при котором органы выделяют не поодиночке, а целым органокомплексом. При эвисцерации сохраняются естественные связи между органами, а также изменения в их топографии, возникшие в результате операции, определяются пределы прорастания опухоли и т. п. Использование метода вскрытия по Шору не препятствует применению специальных способов вскрытия отдельных систем организма (например, эндокринной). Особенности различных способов вскрытия трупов описаны в специальной литературе.

Биопсия Биопсия — прижизненное взятие тканей, органов или взвеси клеток для микроскопического исследования с диагностической целью, а также для изучения динамики патологического процесса и влияния на него лечебных мероприятий. В зависимости от способа взятия материала выделяют инцизионную, пункционную, эндоскопическую и аспирационную биопсии.

Инцизионная биопсия При инцизионной биопсии часть ткани из органа или целый орган иссекают хирургическим путём. Биоптат фиксируют в растворе формалина или другой фиксирующей жидкости, после чего проводят гистологическое исследование. Нередко характер патологического процесса (например, характер опухоли) необходимо установить во время операции. В этих случаях показана срочная биопсия. Ткань фиксируют быстро, обычно путём замораживания её в жидком азоте или с помощью углекислого газа. Затем из биоптата готовят гистологические срезы, окрашивают и исследуют под микроскопом с целью срочной диагностики. Это чрезвычайно важно для определения объёма оперативного вмешательства.

Пункционная биопсия При пункционной биопсии столбик ткани из органа получают с помощью специальной иглы или троакара. Разновидностью пункционной биопсии является трепанобиопсия, при которой получают ткань костей или костного мозга с помощью специального инструментатрепана.

Эндоскопическая биопсия Благодаря развитию эндоскопических методов исследования появилась эндоскопическая биопсия. Особенно широкое распространение получила эндоскопическая биопсия желудка, кишечника и бронхов. Объём материала, полученного с помощью эндоскопа, очень мал, поэтому высокая степень верификации патологического процесса может быть обеспечена только при исследовании 4−6 биоптатов.

Аспирационная биопсия Аспирационную биопсию применяют для исследования жидкого содержимого полых органов или аспирата, полученного из полостей тела с помощью специальных инструментов. С этой же целью изучают диализный раствор из бронхов, желудка, плевральной или брюшной полостей, из полости матки. Полученный материал подвергают в основном цитологическому исследованию.

Подготовка материала Полученные тем или иным путём кусочки ткани для последующей световой микроскопии (СМ) обычно фиксируют в 10% нейтральном забуференном формалине. Для выявления отдельных компонентов клеток используют специальные фиксирующие жидкости — Буэна, Карнуа и др. Фиксированный материал режут на микротоме, после чего применяют обзорные окраски срезов или проводят различные гистохимические реакции. Для электронной микроскопии (ЭМ) существуют специальные методы приготовления биопсийного материала, который затем режут на ультратоме, добиваясь толщины среза в 30−50 нм.

Биопсию применяют и в поликлинике, где широкое распространение получили инцизионные биопсии шейки матки, кожи, пункционные биопсии поверхностно расположенных опухолей, аспирационные биопсии содержимого полости матки, верхнечелюстных (гайморовых) пазух и некоторых других полостей.

Биопсийный материал может быть получен и для ЭМ-изучения. Этот метод наиболее широко используют в онкологии. Иногда только исследование ультраструктуры клеток опухоли позволяет установить её гистогенез.

Микроскопические методы исследования Микроскопические методы исследования — способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине этими методами изучают строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза человека. Основу микроскопических методов исследования составляют СМ и ЭМ. СМ имеет несколько разновидностей, каждая из которых использует различные свойства света:

фазово-контрастная, интерференционная, люминесцентная, поляризационная, стереоскопическая, ультрафиолетовая, инфракрасная.

В ЭМ изображение объектов исследования возникает в результате направленного потока электронов.

Световая микроскопия СМ основывается на таких определяющих факторах, как разрешающая способность микроскопа, направленность светового луча, а также особенности изучаемого объекта, который может быть прозрачным и непрозрачным. В зависимости от свойств объекта изменяются физические свойства света — его цвет и яркость, связанные с длиной и амплитудой волны, фаза, плоскость и направление распространения волны. Для СМ биологические объекты обычно окрашивают для выявления тех или иных их свойств. При этом ткани должны быть фиксированы, так как окраска выявляет определённые структуры только погибших клеток. В живой клетке краситель обособляется в цитоплазме в виде вакуоли и не прокрашивает клеточные структуры. Тем не менее в СМ можно изучать и живые биологические объекты (витальная микроскопия). В этом случае применяют тёмнопольный конденсор.

Фазово-контрастная микроскопия применяется для исследования живых и неокрашенных биологических объектов. Она основана на дифракции луча света в зависимости от особенностей объекта изучения, от которых зависит изменение длины и фазы световой волны. В патологии фазово-контрастная микроскопия находит применение при исследовании простейших, клеток растений и животных, при подсчёте и дифференцировке клеток костного мозга и периферической крови, при изучении клеток культуры тканей и др.

Поляризационная микроскопия позволяет изучать биологические объекты в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях, т. е. в поляризованном свете. Этого достигают с помощью плёнчатых поляроидов или призм Николя, которые помещают в микроскопе между источником света и препаратом. Поляризация меняется при прохождении (или отражении) лучей света через различные и оптически разнородные структуры. В так называемых изотропных структурах скорость распространения поляризованного света не зависит от плоскости поляризации, а в анизотропных структурах скорость его распространения меняется в зависимости от направления света по продольной или поперечной оси объекта. Если показатель преломления света вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, возникает положительное двойное лучепреломление, при обратных взаимоотношениях — отрицательное двойное лучепреломление. Многие биологические объекты имеют строгую молекулярную ориентацию, являются анизотропными и обладают положительным двойным лучепреломлением. Такими свойствами обладают миофибриллы, реснички мерцательного эпителия, коллагеновые волокна и др. Сопоставление характера лучепреломления поляризованного света и величины анизотропии объекта позволяет судить о молекулярной организации его структуры. Поляризационная микроскопия является одним из гистологических, а также цитологических методов исследования, способом микробиологической диагностики и др. Важно, что в поляризованном свете можно исследовать как окрашенные, так и неокрашенные и нефиксированные (нативные) срезы тканей.

Люминесцентная микроскопия основана на свойстве многих веществ давать свечение — люминесценцию в УФ-лучах или в сине-фиолетовой части спектра света. Ряд биологических веществ, таких как простые белки, коферменты, некоторые витамины, лекарственные средства (ЛС) обладают собственной (первичной) люминесценцией. Другие вещества начинают светиться при добавлении к ним специальных красителей — флюорохромов (вторичная люминесценция). Флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно, но могут избирательно окрашивать отдельные клеточные структуры или определённые химические соединения. На этом основано использование люминесцентной микроскопии в цитологических и гистохимических исследованиях. Иммунофлюоресценция в люминесцентном микроскопе позволяет выявлять различные Аг и их концентрацию в клетках, при этом возможна идентификация вирусов, определение AT и иммунных комплексов, гормонов, различных продуктов метаболизма и др. Люминесцентную микроскопию применяют для диагностики вирусных инфекций, с помощью вторичной люминесценции диагностируют злокачественные опухоли в гистологических и цитологических препаратах, определяют очаги ишемии мышцы сердца при ранних сроках инфаркта миокарда, выявляют амилоид в биоптатах тканей и т. д.

Ультрафиолетовая и инфракрасная микроскопия основана на способности поглощения УФи инфракрасных лучей определённых длин волн некоторыми веществами, входящими в состав живых клеток, микроорганизмов или фиксированных, но не окрашенных тканей, прозрачных в видимом свете. Свойством поглощать УФ-лучи обладают высокомолекулярные соединения, такие как нуклеиновые кислоты, белки, ароматические аминокислоты (тирозин, триптофан, метилаланин), пуриновые и пиримидиновые основания и др. С помощью УФ-микроскопии изучают локализацию и количество таких веществ, а при исследовании живых объектов — их изменения в процессе жизнедеятельности. Инфракрасная микроскопия применяется в медицине преимущественно в нейроморфологии и офтальмологии.

Для специальных целей в патологии используются и другие микроскопические методы — интерференционная, стереоскопическая микроскопия и др.

Электронная микроскопия ЭМ применяют для изучения структуры клеток, микроорганизмов и вирусов на субклеточном и макромолекулярном уровнях. Значительную разрешающую способность ЭМ обеспечивает поток электронов, проходящих в вакууме через электромагнитные поля, создаваемые электромагнитными линзами. При трансмиссионной ЭМ электроны проходят через структуры исследуемого объекта, а при сканирующей ЭМ они отражаются от этих структур, отклоняясь под разными углами. В результате возникает изображение на люминесцирующем экране микроскопа. При трансмиссионной (просвечивающей) ЭМ получают плоскостное изображение внутриклеточных структур, при сканирующей — объёмное. Весьма полезно сочетание ЭМ с другими методами — авторадиографией, гистохимическими, иммунологическими методами. Возникает возможность наблюдать течение биохимических и иммунологических процессов в клетке в сочетании с изменениями внутриклеточных структур. ЭМ требует специальной химической или физической фиксации тканей. Для исследования берут в основном биопсийный материал. Может быть использован и секционный материал, но в максимально короткие сроки после смерти, обычно исчисляемые минутами. После фиксации ткани обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на ультратомах. При этом получают ультратонкие срезы тканей толщиной 30−50 нм. Их контрастируют, переносят на специальные металлические сетки и затем изучают в ЭМ.

При ультратомировании препарата можно получить так называемые полутонкие срезы толщиной 1,5 мкм, которые после окраски метиленовым синим исследуют в СМ. Это позволяет получить представление о состоянии той ткани, клетки которой будут затем изучены в ЭМ. Метод может иметь и самостоятельное значение.

В сканирующем (растровом) ЭМ исследуют поверхность биологических и небиологических объектов, напыляя в вакуумной камере на их поверхность электроноплотные вещества и изучая эти реплики, повторяющие контуры объекта исследования.

Методы окрашивания Микроскопические методы используют в медицине в сочетании с гистологическими методами исследования клеток и тканей. Для этого, как правило, фиксированные тканевые срезы должны быть окрашены с целью выявления различных клеточных структур. Последние воспринимают красители в зависимости от их физико-химических свойств. Поэтому красители подразделяют на основные, кислые и нейтральные.

Основные, или базофильные, красители являются красящими основаниями или их солями (гематоксилин, метиленовый синий, толуидиновый синий и др.). В цветовой гамме этих красителей преобладают оттенки синего цвета. Интенсивность окраски (базофилия) зависит от числа кислотных групп в структурах клетки, способных взаимодействовать с основными красителями. Кислые, или ацидофильные, красители — красящие кислоты или их соли, окрашивающие клеточные структуры в различные оттенки красного (эозин, эритрозин, Конго красный, оранж и др.). Нейтральные, красители содержат и базофильные, и ацидофильные вещества (например, смесь Романовского-Гимзы). Такие красители могут обладать способностью растворяться в определённых веществах, окрашивая их (судан III, шарлах и др.). Нередко для контрастирования структур клеток или тканей используют методы, основанные на способности этих тканей удерживать или восстанавливать соли тяжёлых металлов (серебра, золота, осмия, свинца и др.). Эти методы контрастирования называются импрегнацией, они используются как в СМ, так и в ЭМ.

С помощью различных красителей в повседневной и научной практике применяют обзорные окраски для составления общего представления о состоянии исследуемой ткани (гематоксилин и эозин, азур-фукселин и др.), а также специальные окраски для выявления особенностей процессов, протекающих в тканях и клетках. Так, используют окраску Суданом III для выявления жировой дистрофии клеток, Конго красным — для определения отложений амилоида, импрегнацию серебром — для исследования нервной ткани и т. п. Живые и неокрашенные объекты исследуют с помощью специальных микроскопических методов, описанных выше.

Гистохимические методы Гистохимические и гистоферментохимические методы позволяют проследить и оценить обмен веществ в тканях и клетках в норме и вусловиях патологии; избирательно оценить метаболизм белков, липидов, углеводов и других метаболитов, локализацию и активность ферментов и гормонов, проанализировать особенности окислительно-восстановительных процессов, протекающих в клетках и тканях в условиях патологии, при приспособлении и компенсации. Диапазон применения гистохимических методов в патологии необычайно широк. Для гистохимических исследований используют срезы свежезамороженных тканей, приготовленные в криостате, что позволяет сохранить прижизненную локализацию того или иного химического соединения. Гистохимические методы часто сочетают с другими методами СМ и ЭМ. Для количественной оценки результатов гистохимических реакций применяют гистофотометрию, цитофотометрию, микрофлюорометрию и др.

Цитологическое исследование мазков, соскобов и отпечатков Традиционными методами, используемыми патологоанатомами для диагностики различных заболеваний, являются цитологическое исследование мазков, соскобов и отпечатков ткани из различных органов и морфологическое изучение замороженных или заключённых в парафин биоптатов органов и тканей. Цитологические исследования позволяют дать предварительный диагноз в течение 20−30 мин, они широко применяются в поликлинической и хирургической практике. Однако при цитологическом исследовании нарушаются взаимоотношения между различными клетками и внеклеточным матриксом. Кроме того, в цитологическом образце могут отсутствовать отдельные типы клеток. Поэтому цитологические данные часто носят предварительный характер, а окончательный диагноз ставят после морфологического исследования биоптата через 4−5 дней. Использование срезов, полученных из замороженной ткани (криостатных срезов), позволяет ускорить обработку материала до 1−2 ч, но за счёт ухудшения морфологической картины. В связи с этим исследование биопсийного материала, заключённого в парафин, остаётся основным подходом в патологоанатомической диагностике. Очень информативна иммуноцитохимия. Используя специфические AT и эффективные системы их визуализации, можно получить данные, определяющие выбор терапии заболевания и его прогноз. Особенно эффективно использование этих методик при диагностике опухолей, иммунных, аутоиммунных и воспалительных процессов.

Авторадиография Близка к гастохимическим методам исследования авторадиография, основанная на выявлении в клетках и в субклеточных структурах в СМ или ЭМ локализации радиоактивных изотопов. Метод позволяет визуально оценить интенсивность метаболизма в клетках и во внутриклеточных структурах, а также в структурах различных микробных и вирусных возбудителей болезней. Авторадиография позволяет наблюдать динамику процессов метаболизма, так как би в-частицы используемых изотопов, локализуясь и перемещаясь в определённых структурах, оставляют след на фотоэмульсии, которой покрывают гистологический или ультратонкий срез ткани.

Молекулярно-биологические методы Бурное развитие и прогресс в области иммунологии, генетики, биотехнологии, клеточной и молекулярной биологии привели к дальнейшему совершенствованию методического арсенала патолога. В области цитологии появились цитологические центрифуги (цитоспины), позволяющие сконцентрировать клетки из различных биологических жидкостей и получить качественный клеточный монослой, пригодный для цитологического и иммуноцитологического исследований в минимальные сроки.

Проточная цитофлюориметрия Важным достижением в области цитологии явилось использование проточной цитофлюориметрии. Проточный цитофлюориметр — прибор, позволяющий производить качественный и количественный анализы физических и биологических параметров клеток, фенотипирование лейкоцитов, ДНК-анализ. Прибор автоматически измеряет количество света из флюорохрома, связанного со специфическими AT (CD3, CD4, CD8, CD19 и т. д.) или определёнными веществами (например, этидиумом бромида — 4', 6-диамидино-2-фенилиндолом [DAPI]), окрашивающими ДНК или РНК. Используя различные флюорохромы, можно получить многопараметровые данные из одного образца. Сигнал из каждой клетки собирается в течение нескольких микросекунд при прохождении клетки через лазерный пучок, обрабатывается компьютером и представляется на дисплее в виде количественных данных. Образцы, содержащие суспензию или мелкие агрегаты клеток, готовятся в течение 2−3 ч. Наиболее широко проточная цитофлюориметрия стала использоваться в цитологической практике после развития ультразвуковой диагностики и применения техники тонкоигольчатой аспирационной биопсии. В отличие от обычной биопсии, тонкоигольчатая аспирационная биопсия менее травматична, не требует специальной подготовки больного и стерильных условий. Из получаемого аспирационного материала готовят мазок для цитологического исследования и клеточную суспензию для проточной цитофлюориметрии. Недостатком тонкоигольчатой аспирационной биопсии является её меньшая информативность и невозможность получения суспензии клеток из солидных тканей для проточной цитофлюориметрии.

Метод двойной или тройной метки Совершенствование систем визуализации флюоресцентных и ферментных меток позволило использовать несколько помеченных разными метками различных AT на одном препарате при иммуногистохимическом исследовании. Это метод двойной или тройной метки.

Этот методический подход особенно важен при исследовании гетерогенной по составу ткани и позволяет выявить распределение различных популяций клеток при инфильтративном росте опухолей, развитии локального иммунного ответа и т. д. При определённых условиях одна и та же клетка может экспрессировать несколько Аг (коэкспрессия), выявляемых обычно на различных клетках. В таких случаях используют флюоресцентный микроскоп, изображение с которого передаётся в компьютер.

Ещё более эффективно исследование таких препаратов с помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии. Монохромный источник освещения (лазер) не даёт оптических искажений и позволяет сканировать клетки в срезе или мазке в одной плоскости на различной глубине. Специальная компьютерная программа позволяет совмещать изображения одних и тех же участков, содержащих клетки с различными флюорохромами, и анализировать распределение различных меток на клетках. При совпадении меток и наложении их друг на друга появляется псевдоцветное свечение жёлтого цвета.

Гибридизация in situ.

В последнее десятилетие в патологии активно используют гибридизационную иммуногистохимию, или гибридизацию in situ. Эта техника, в отличие от описанных выше, способна продемонстрировать распределение специфических последовательностей ДНК или РНК в индивидуальных клетках на срезах ткани, в мазке, в культуре клеток, хромосомных препаратах.

Гибридизация in situ способна определять 20−50 копий определённых последовательностей ДНК или РНК в одной клетке. Таким образом, этот метод позволяет судить о биосинтетической активности отдельных клеток при их прямой визуализации и широко используется в диагностике инфекционных заболеваний и неопластических процессов, включая онкогены, гены-супрессоры, ростовые факторы и факторы, регулирующие клеточный цикл. Например, эта техника используется для идентификации экспрессии РНК в опухолях эндокринной системы, негативных при иммуногистохимической окраске. Гибридизация in situ является также важным инструментом в мониторинге генной терапии, поскольку позволяет выявлять локализацию и распределение терапевтических генов, трансфецированных вирусными или плазмидными векторами в клетки или органы. Недостатком гибридизации in situ является её относительно низкая чувствительность. Этот недостаток с успехом компенсируется использованием полимеразной цепной реакции.

Микродиссекция В связи с вышеизложенным, был предложен метод микродиссекции, позволяющий вырезать отдельные идентифицированные клетки или группы клеток с последующим их анализом с помощью обычной ПЦР. Первые шаги в этом направлении были сделаны путём вырезания бритвой или соскобов интересующих участков ткани на срезе под микроскопом. В дальнейшем стали использовать микроманипуляторы, позволяющие точно выделить отдельные скопления клеток. В обоих методах процесс микродиссекции очень долог и во многом зависит от мастерства оператора. В настоящее время для точной и воспроизводимой микродиссекции всё чаще используют лазеры. В ряде приборов применён принцип лазерной микропучковой микродиссекции, когда точно сфокусированным пучком ультрафиолетового лазера вырезают клетки или область, защищенную фотопигментом, предотвращающим разрушение ДНК в УФ-свете. В других приборах используют принцип лазерного захвата. Этот принцип основан на селективном прилипании выбранных клеток или фрагментов ткани к термопластической мембране, активированной пульсами низкоэнергетического инфракрасного лазера. Термопластическая мембрана, используемая для переноса выбранных клеток, имеет диаметр около 6 мм и располагается на дне оптически прозрачной крышки, которая закрывает 0,5 мл микроцентрифужную пробирку с раствором для экстракции ДНК или РНК. Морфология вырезанных клеток хорошо сохраняется и может быть документирована на всех стадиях процедуры. Поскольку микродиссекция с лазерным захватом не разрушает окружающие ткани, 2−3 участка, содержащие разнородные морфологические структуры (нормальные, пограничные и опухолевые клетки), могут быть взяты для анализа с одного препарата. В настоящее время микродиссекция с лазерным захватом широко используется для анализа генетических изменений ДНК, определения потери гетерозиготности в инвазивных опухолях.

Таким образом, современный патолог обладает возможностью использовать значительный арсенал методов, начиная с рутинных и заканчивая молекулярно-биологическими, для диагностики цитологического и биопсийного материалов.

Выбор тех или иных методов обусловливается видом материала (мазок, криостатный или парафиновый срез), особенностями его фиксации, гистоархитектурными особенностями ткани и конечными целями исследования.

Список литературы

аутолитический смерть труп патологоанатомический вскрытие.

• 1. Авдеев М. И. Судебно-медицинская экспертиза трупа. Руководство. М.: Медицина, 1976.
• 2. Мельников Ю. Л., Жаров В. В. Судебно-медицинское определение времени наступления смерти. М.: Медицина, 1978.
• 3. Хижнякова К. И. Возможности судебно-медицинской экспертизы при определении временит наступления смерти. М., 1973.
• 4. Струков А. И., Серов В. В. Паталогическая анатомия М.: Литерра 2010.