Варианты постановки ИФА

Общий принцип.

В настоящее время используется огромное количество всевозможных разновидностей и модификаций ИФА. Широкое распространение получили разные варианты твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Твердофазный ИФА был предложен в 1971 году. Основные принципы твердофазного ИФА, независимо от модификации, заключаются в следующем:

• 1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием.
• 2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. В лунках с положительным контролем — стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Несвязавшиеся компоненты удаляют отмыванием.
• 3. При добавлении конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.

Важный этап любого варианта твердофазного анализа — процедура отмывки от несвязавшихся реагентов. Важно не просто сполоснуть фиксированные на твердой фазе компоненты, а удалить реагенты из всей глубины слоя. Это наиболее длительные и трудоемкие этапы анализа. Промывание проб может производиться в автоматическом режиме с помощью специального прибора — вошера или вручную, многоканальной пипеткой. Для проведения ИФА необходимы:

• — полистироловый планшет или другие использующиеся варианты твердой фазы;
• — отмывающий раствор;
• — конъюгат (меченные ферментной меткой антигены или антитела);
• — смесь используемых субстратов;
• — останавливающий раствор (Стоп-реагент — раствор для останавливания реакции);
• — образцы, использующиеся для положительного и/или отрицательного контроля;
• — стандартный антиген (для построения калибровочной кривой);
• — однои многоканальные пипетки;
• — вошер (промыватель);
• — оптический прибор для определения оптической плотности исследуемого раствора (ИФА-ридер, считыватель, который последовательно фотометрирует все лунки);
• — 5−100 мкл исследуемого биологическою материала.