Определение МИФ-активности. 
История изучения цитокинов

Определение биологической активности МИФ проводят с помощью устройства для формирования клеточных микрокультур — МИГРОСКРИН (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН).

• 1. В лунки 96-луночного планшета (Flow, Великобритания или аналогичные) добавляют по 100 мкл разведенной на культуральной среде пробы, в которой определяют МИФ-активность (каждое разведение в 4 параллелях, опытные пробы). Культуральная среда включает RPMI 1640, 2 mM L-глутамина, 5% сыворотки эмбриона коровы, 40 мкг/мл гентамицина.
• 2. В контрольные лунки добавляют культуральную среду (в 4 параллелях) по 100 мкл.
• 3. Готовят клеточную суспензию перитонеальных макрофагов, для чего 2 мышам-гибридам (СВАхС57В1/6) F1 внутрибрюшинно вводят по 10 мл раствора Хенкса с гепарином (10 ЕД/мл), осторожно массируют брюшко в течение 2−3 мин. Затем животное забивают декапитацией, осторожно прокалывают брюшную стенку в области паха и через иглу шприцем отсасывают экссудат. Клетки перитонеального экссудата дважды отмывают раствором Хенкса, центрифугируя их 10−15 мин при 200 g. Затем готовят суспензию клеток с концентрацией 10±1 млн/мл среды RPMI 1640. Подсчет проводят в камере Горяева.
• 4. Собирают систему МИГРОСКРИН, представляющую собой штатив для направленной и стандартной фиксации наконечников с клеточными культурами в строго вертикальном положении на заданной высоте над центром лунки 96-луночного культурального планшета, а также включающую 92 наконечника для автоматической пипетки фирмы «Costar», USA.
• 1. Схема МИГРОСКРИН — устройства для количественной оценки миграции клеточных культур

Вставляют ножки штатива в угловые лунки планшета. Клеточную суспензию набирают автоматической пипеткой в наконечники — по 5 мкл в каждый, ополаскивают от избытка клеток однократным опусканием в среду и вставляют вертикально в гнезда штатива системы. Заполненный штатив с наконечниками выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч на строго горизонтальной поверхности. За это время происходит оседание клеток суспензии на дно лунок, где формируются стандартные клеточные микрокультуры.

• 5. Штатив с наконечниками осторожно снимают с планшета. Планшет с микрокультурой клеток помещают в строго горизонтальном положении в СО2-инкубатор, где культивируют в течение 20 ч. В ходе культивирования клетки мигрируют по дну лунки.
• 6. Количественный учет результатов после инкубации проводят на бинокулярной лупе, визуально оценивая размер колонии по шкале внутри окуляра. Микрокультуры имеют форму круга. Затем исследователи определяют среднее значение диаметра колоний по результатам измерения колоний в 4 опытных или контрольных лунках. Погрешность измерения равна ±1 мм.

Индекс миграции (ИМ) рассчитывают по формуле:

Проба обладает МИФ-активностью, если значения ИМ равны 0,6±0,2.

За условную единицу (ЕД) МИФ-активности принимают обратную величину, равную значению наибольшего разведения пробы (образца), при котором индекс миграции равен 0,6±0,2.

Биологическую активность ФЕOб оценивают по цитотоксическому его действию на линию трансформированных фибробластов L-929. В качестве положительного контроля используют рекомбинантный ФНОа, а в качестве отрицательного контроля — клетки в культуральной среде.

Вычисляют цитотоксический индекс (ЦИ):

где a — количество живых клеток в контроле; b — количество живых клеток в опыте.

Клетки окрашивают красителем (метиленовым синим), который включается только в погибшие клетки.

За условную единицу активности ФНО принимают значение обратного разведения образца, необходимого для получения 50% клеточной цитотоксичности. Удельная активность образца — отношение активности в условных единицах на 1 мл к концентрации белка, содержащегося в образце.

Внутриклеточное окрашивание цитокинов. Изменение соотношения клеток, продуцирующих различные цитокины, может отражать патогенез заболевания и служить критерием прогноза заболевания и оценки проводимой терапии.

Методом внутриклеточного окрашивания определяют экспрессию цитокина на уровне одной клетки. Проточная цитофлуориметрия позволяет подсчитать количество клеток, экспрессирующих тот или иной цитокин.

Нестимулированные клетки продуцируют небольшие количества цитокинов, которые, как правило, не депонируются, поэтому важным этапом оценки внутриклеточных цитокинов являются стимуляция лимфоцитов и блокада выхода этих продуктов из клеток.

В качестве индуктора цитокинов чаще всего используют активатор протеинкиназы С форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) в комбинации с ионофором кальция иономицином (ИН). Применение такого сочетания вызывает синтез широкого спектра цитокинов: ИФНу, ИЛ-4, ИЛ-2, ФНОб. Недостаток использования ФМА-ИН — проблемы выявления CD4-молекул на поверхности лимфоцитов после такой активации. Также продукцию цитокинов Т-лимфоцитами индуцируют с помощью митогенов (ФГА). В-клетки и моноциты стимулируют ЛПС.

Мононуклеарные клетки инкубируют в присутствии индукторов продукции цитокинов и блокатора их внутриклеточного транспорта брефельдина, А или моненсина в течение 2−6 ч.