Иммунохимическая оценка нарушений функций гематоэнцефалического барьера у новорожденных с перинатальными гипоксическими поражениями центральной нервной системы

Изучены изменения концентрации нейротрофического фактора головного мозга BDNF и структурного белка астроцитарной глии S-100 у новорожденных, перенесших тяжелую внутриутробную гипоксию и асфиксию в родах. Все дети были рождены женщинами с неблагоприятными соматическими, гинекологическими и акушерскими факторами анамнеза. Установлено, что изменение сывороточной концентрации S-100 и BDNF у новорожденных группы риска является прогностически неблагоприятным для формирования структурных поражений головного мозга.

Несмотря на успехи перинатальной медицины, частота поражения ЦНС у новорожденных снижается пока незначительно. Гипоксия рассматривается как основной патогенетический фактор повреждения мозга плода и новорожденного, частота гипоксических поражений головного мозга варьирует от 0,6 до 18%. К группе риска по возникновению тяжелых поражений ЦНС относятся недоношенные дети, дети с внутриутробной гипотрофией, внутриутробно инфицированные, рожденные женщинами с отягощенным течением беременности и родов. Широко применяемым методом диагностики поражения мозга у новорожденных и детей раннего возраста является нейросонография. Однако исследование имеет ряд ограничений и не всегда позволяет определять формирование дальнейших морфологических изменений, особенно при небольших кровоизлияниях и повышении эхогенности перивентрикулярных областей, которое выявляется у большинства недоношенных новорожденных [1, 5, 7, 16].

Процессы роста и восстановления структур ЦНС до конца еще не изучены, что ограничивает возможности оценки дальнейшего развития ребенка. У недоношенных детей, родившихся в тяжелом состоянии, иногда даже обширное повреждение мозга в первом полугодии жизни не приводит к формированию неврологического дефицита и очаговых нарушений.

Определение у новорожденных нейроспецифических белков (НСБ) в качестве маркеров различных патологических состояний, наряду с методами нейровизуализации и электрофизиологическим обследованием, относится к числу перспективных направлений диагностики перинатальной патологии. Преимуществами иммунохимического анализа уровня НСБ в биологических жидкостях (плазма крови, цереброспинальная жидкость) по сравнению с другими методами диагностики являются высокая чувствительность, точность и малые количества (0,2−0,5 мкл) исследуемого материала. Диагностически значимые изменения уровня НСБ в ликворе и плазме выявляются значительно раньше, чем те повреждения, которые можно обнаружить любыми другими доступными методами инструментального обследования [2,3].

Изучение динамики уровня НСБ в биологических жидкостях позволяет не только проводить раннюю диагностику церебральных повреждений, но и контролировать эффективность проводимой терапии.

Целью нашего исследования было изучение изменения сывороточной концентрации структурного белка астроцитарной глии S-100 и нейротрофина BDNF (фактор роста, выделенный из головного мозга) и их участия в патогенезе тяжелых гипоксически-ишемических поражений ЦНС у новорожденных различного гестационного возраста.

Под нашим наблюдением находились 90 детей с гестационным возрастом от 25 до 42 недель, массой тела при рождении от 890 до 4630 г. Мальчиков было 59, девочек — 31. Детей распределили по трем группам в зависимости от срока гестации: 1-я -25−31 неделя, 2-я — 32−37, 3-я — 38−41. В каждой группе было по 30 детей. Пробы крови для определения белка S-100 забирали на 1,3,7,14,21-е сутки жизни, а для белка BDNF — в первые 48 часов и на 3−5-е сутки жизни. Полученную сыворотку в объеме 0,5 мл замораживали и хранили при температуре -20°С не более 2 месяцев.

Содержание белка S-100 устанавливали твердофазным иммуноферментным методом с помощью реактивов фирмы «CanAg» (Швеция). Стандарты и образцы пациентов инкубировали вместе с биотинилированными анти8−100 моноклональными антителами (полученными из мыши) в покрытых стрептавидином ячейках микропланшета. В процессе инкубации белок S-100, содержащийся в стандартах или образцах пациентов, адсорбировали на покрытых стрептавидином ячейках микропланшета с биотинилированными анти8−100 моноклональными антителами. Затем стрипы промывали и инкубировали с анти8−100 моноклональными антителами, меченными пероксидазой хрена. После промывки в каждую ячейку добавляли буферный субстрат, проходила ферментная реакция. В процессе реакции в присутствии антигена появлялась голубая окраска. Интенсивность окраски пропорциональна количеству антигена S-100, присутствующему в образце и ее измеряли на микропланшетном ридере при длине волны 450 нм после добавления стоп раствора. Стандартные кривые строили для каждого анализа в координатах: оптическая плотность соответствовала определенной концентрации для каждого стандарта. Концентрацию S-100 в образцах пациента рассчитывали, но калибровочной кривой.

Принцип тест-системы для определения белка BDNF фирмы «R&D» (Англия) основан на количественном иммуноферментном анализе сэндвичевого типа. Моноклональные антитела к BDNF наносили в ячейки микропланшета. Стандарты и образцы вносили в ячейки и присутствующий в них BDNF связывался с антителами. Вторые антитела к BDNF, меченные ферментом, вносили в ячейки. Последующая промывка удаляла несвязанный конъюгат антител с ферментом, после этого в ячейки добавляли раствор ферментного субстрата. Интенсивность окраски была пропорциональна количеству BDNF, связавшегося на первом шаге анализа. Цветную реакцию останавливали и считывали оптическую плотность ячеек. Оптическую плотность определяли при длине волны 450 нм.

Для получения нормативных показателей S-100 и BDNF использовали пробы сыворотки здоровых доношенных детей (15 чел.), а также недоношенных детей без поражения ЦНС (15). Нормальные значения белка S-100 были равны 0,18−0,3 мкг/л, BDNF — 1,0−3,9 нг/мл. Все дети были рождены матерями с отягощенным течением беременности и родов. По тяжести перенесенной гипоксии дети были разделены на две группы: тяжелая (оценка по шкале Апгар на первой минуте — 1−4 балла) и умеренная (5−7 баллов). При рождении состояние всех детей расценивалось как тяжелое или средней тяжести. Всем детям, родившимся в тяжелом состоянии, проводился комплекс первичных реанимационных мероприятий. Состояние средней тяжести было констатировано у 9 пациентов, что потребовало проведения посиндромной терапии в условиях родильного дома. На 2−3-е сутки состояние пациентов ухудшилось, и их перевели в отделение реанимации новорожденных. Оценка по шкале Апгар на первой минуте жизни составляла 1−4 балла у 45 детей, 5−7 баллов — у 29, 7−8 баллов — у 16. Все новорожденные имели признаки тяжелого перинатального поражения ЦНС, которое было диагностировано на основании осмотра, оценки динамики неврологического статуса и нейросонографического обследования. Основными клиническими проявлениями были угнетение ЦНС (у 81), судороги — у 30, кома — у 5. Тяжесть состояния детей была вызвана комплексом различных патологических процессов — внутриутробной пневмонией, дыхательными расстройствами, гемолитической болезнью, нарушением водно-электролитного баланса. В связи с наличием и тяжестью дыхательной недостаточности 82,2% обследованных потребовалось проведение искусственной вентиляции легких с первых часов жизни, причем половине из них — в первые 5 минут жизни. В отделение реанимации интенсивной терапии переводили на 1−3-е сутки жизни. Длительность ИВ Л составляла в среднем 7 суток (максимально 32).

Каждая группа новорожденных была разделена на две подгруппы: в первую включали детей, у которых по данным нейросонографии структурной патологии мозговой ткани не выявлялось, однако имелась клиническая картина тяжелого гипоксически-ишемического поражения ЦНС, во вторую — с интравентрикулярными кровоизлияниями различной степени и перивентрикулярной лейкомаляцией (см. табл. 1).

Таблица 1.

Исходная сывороточная концентрация белка S-100 была повышена в первые сутки у всех обследованных. У детей, родившихся в состоянии тяжелой асфиксии, в первые сутки показатели белка S-100 были значительно выше (в среднем 2,5 мкг/л), чем у новорожденных с оценкой по Апгар в 5−7 баллов (в среднем — 1,1 мкг/л). Эти результаты свидетельствовали о более высокой проницаемости ГЭБ при тяжелой асфиксии. Показатели белка BDNF у новорожденных с острой асфиксией в первые сутки жизни, напротив, были несколько ниже, чем в группе с умеренной. Средние показатели представлены на рис. 1 и 2.

При изучении динамики уровня белка S-100 у детей с перинатальным поражением ЦНС было выявлено следующее: во всех трех группах отмечались значительное увеличение концентрации в первые 48 часов жизни, а затем ее постепенное снижение. Самая высокая концентрация белка S-100 была у недоношенных детей со структурными изменениями первой группы (более чем в 12 раз), что может быть объяснено деструктивными изменением в клетках мозга (рис. 3).

Сохранение повышенной концентрации S-100 ассоциировалось с увеличением частоты формирования тяжелого поражения ЦНС, а также, возможно, с активной пролиферацией микроглии при деструктивном процессе. Наиболее высокие уровни белка S-100 коррелировали с неблагоприятным прогнозом. У детей с постгипоксическими поражениями в виде внутрижелудочковых кровоизлияний (ВЖК) и/или перивентрикулярной лейкомаляции (ПВЛ) с последующей кистозной дегенерацией значение сывороточной концентрации белка S-100 на протяжении первого месяца жизни было выше, чем у детей, у которых не было аналогичных изменений на НСГ.

Анализ неврологической симптоматики показал, что сроки ее регрессии прямо коррелировали с сывороточным уровнем белка S-100 — чем выше он был в первые 72 часа жизни, тем медленнее происходила нормализация функций ЦНС даже у детей без структурных изменений по результатам НСГ. При сравнении скорости регрессии неврологической симптоматики с динамикой сывороточного уровня белка S-100 в разные сроки взятия крови было установлено, что у тех детей, у которых его уровень на 14−21-е сутки жизни обнаруживал отклонение от нормы не более чем на 30%, восстановление функциональной активности мозга происходило раньше. Сывороточная концентрация белка S-100 у детей со структурными изменениями по данным НСГ была выше у детей раннего гестационного возраста с задержкой внутриутробного развития и острой асфиксией. Можно предположить, что длительная предшествующая рождению хроническая внутриутробная гипоксия, обусловливая нарушение маточно-плацентарно-плодового кровотока, формирует фоновые сосудисто-тканевые процессы, нарушающие целостность гематоэнцефалического барьера (ГЭБ).

Показатели сывороточной концентрации белка BDNF значительно изменялись в зависимости от характера поражения мозга. На рис. 4 представлена динамика изменения нейротропного фактора головного мозга у новорожденных с внутрижелудочковым кровоизлиянием и у новорожденных с сочетанием перивентрикулярной лейкомаляцией и ВЖК.

мозг повреждение новорожденный белок Так, у детей с ВЖК резко возрастали показатели нейротрофина в первые сутки жизни, а у детей с тяжелым ишемическим поражением они были крайне низкими. Полученные данные свидетельствовали о повышенном синтезе трофических факторов в первые часы после индукции ишемии. Эти результаты согласуется с данными исследователей, установивших, что при экспериментальной ишемии мозга возрастает активность матричной РНК, кодирующей нейротрофины NGF и BDNF в клетках мозга. Низкое содержание нейротрофина имело место у крайне тяжелых пациентов, впоследствии умерших. Наиболее демонстративными показателями нейротрофина (рис. 5) были у новорожденных с разным исходом заболевания.

У детей с ишемией без формирования изменений мозга в первые сутки отмечался подъем уровня белка BDNF в 2−2,5 раза. Это, по-видимому, способствовало сохранению структурной организации мозга. У новорожденных же с перивентрикулярной лейкомаляцией, умерших и выживших со структурными изменениями мозга, имел место низкий уровень нейротрофина. Причем, если у выживших пациентов с указанной патологией (лейкомаляция и с грубыми структурными повреждениями) уровень нейротрофина при втором измерении существенно возрастал, то у умерших впоследствии он оставался на низких значениях.

Таким образом, среди критериев неблагоприятного прогноза у детей с тяжелым поражением ЦНС выступали крайне высокие и резко сниженные концентрации BDNF в первые сутки жизни, а также увеличение концентрации белка S-100 в первые 72 часа жизни. Иммунобиохимический мониторинг позволяет выделить группу риска на самом раннем этапе наблюдения, а также обозначить наиболее достоверные критерии, определяющие тяжесть поражения, открывает дополнительные возможности контроля за состоянием пациентов и проводимой терапией.