Материалы и методы исследования

Объектом наших исследований служил пескожил (Arenicola marina), класс Polychaeta, тип Annelida, обитающий на литорали и сублиторали Белого моря.

Подготовка целомоцитов

Пробы целомической жидкости брали в районе туловищных сегментов охлажденными до 4ОС стерильными шприцами. Плазму целомической жидкости отделяли центрифугированием и ресуспендировали осадок целомоцитов в фильтрованной морской воде (4ОС). Концентрация клеток определялась с помощью подсчета в камере Горяева.

Подготовка хемоаттрактантов

Препарат ареницина, выделенного из целомоцитов с помощью препаративных биохимических методов, включающих препаративный электрофорез и ВЭЖХ, готовился в разведении от 10 до 1 мкг? мл в фильтрованной морской воде.

Препарат липополисахарида (ЛПС) (Sigma, St. Louis, USA from E. coli 0111: B4) также готовился в фильтрованной морской воде. Тестировались следующие разведения: 100, 50, 20, и от 10 до 1 мкг? мл.

Изучение хемотаксиса

Рис. 1 Миграция целомоцитов в ответ на ареницин. Рис. 2 Миграция целомоцитов в ответ на ЛПС

Миграция целомоцитов оценивалась с помощью 48-луночной камеры Бойдена для микрохемотаксиса (Neuroprobe, MD). Использовались поликарбонатные мембраны (Neuroprobe), размер пор 3 мкм. В нижние лунки вносили раствор хемоаттрактанта в различной концентрации (объем лунки 25 мкл). В качестве контроля использовалась фильтрованная морская вода. Верхние содержали суспензию целомоцитов (107 клеток? мл), объем лунки 48 мкл. Камеру инкубировали 1 час при 10−15 ОС. После инкубации мембрану снимали, клетки с верхней поверхности убирали с помощью специального резинового лезвия. Клетки прикрепившиеся к нижней поверхности фиксировали в растворе Май-Грюнвальда и окрашивали 10% раствором Гимза. Количество целомоцитов на мембране оценивалось подсчетом под микроскопом (увеличение X40), считали клетки в 10 полях зрения. Каждое разведение тестировали в трипликате, эксперименты повторяли три или более (5 в случае ЛПС) раза.