Лабораторные исследования. 
Профилактика лептоспироза крупного рогатого скота

Они включают в себя микроскопические, бактериологические, биологические, гистологические и серологические методы 4.

Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют нативную или цитрированную кровь, мочу, околоплодные воды, абортированный плод; для посмертного — трупы мелких животных, от крупных животных кусочки паренхиматозных органов, транссудат грудной и брюшной полостей, мочевой пузырь, спиномозговую жидкость. Мочу отбирают при естественном мочеиспускании не менее чем от 100 животных, исследуют в «темном поле» микроскопа не позднее 6−12 часов хранения при 4 °C; остальной патологический материал — не позднее 6 часов в летнее время, 10−12 часов — в зимнее время. Для серологического исследования у животных берут не менее 50 проб крови двукратно, с промежутком 7−10 дней 4.

Микроскопическое исследование. Обнаружение лептоспироза в нативных препаратах осуществляют с помощью конденсора «темное поле» осветителя ОИ-13 или ОИ-19 при увеличении в 280−400 раз или после окраски флюоресцирующим глобулином в люминисцентных микроскопах МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3, МЛД 4.

В «темном поле» микроскопа исследуют мочу, околосердечную жидкость, транссудаты из грудной и брюшной полостей, цитрированную кровь в нативном состоянии или в виде осадка после цинтрифугирования в течение 30 минут при 10−15 тыс. об/мин, суспензии из почек, легких, печени больных и павших сельскохозяйственных или экспериментально инфицированных лабораторных животных, которые предварительно отстаивают 30 минут при 4 °C, центрифугируют 10 минут при 3 тыс. об/мин, отбирают для исследования надосадочный слой. Из каждого исследуемого материала на стеклах готовят не менее 10 препаратов «раздавленная капля», просматривают до 50 полей зрения для обнаружения морфологически характерных подвижных лептоспир 4.

Иммунофлюоресцентные исследования проводят с использованием специфического флюоресцирующего глобулина. Сухой глобулин предварительно растворяют стерильной дистиллированной водой до указанного на этикетке ампулы первоначального объема. Растворенный глобулин дополнительно разводят физиологическим раствором (pH 7,4−7,5) до рабочего разведения, также указанного на этикетке ампулы, переносят в стерильную пробирку, консервируют мертиолятом в соотношении 1: 10 000 (0,1 мл 1%-ного раствора мертиолята на 10мл глобулина), закрывают резиновой пробкой и хранят (до 1 месяца) при температуре 2−10°С. Рабочее разведение глобулина без консерванта можно использовать только в течение 5 дней при условие хранения его при температуре 2−5°С 5.

Исследуют кровь, паренхиматозные органы, транссудат из грудной и брюшной полостей, перикардиальную и спиномозговую жидкость, мочу больных и павших животных, органы и ткани абортированного плода, из которого готовят мазки 5.

Мазки готовят при комнатной температуре, фиксируют ацетоном 5 минут или этиловым спиртом 15 минут и снова высушивают на воздухе. На каждый мазок наносят 3−5 капель рабочего разведения флюоресцирующего глобулина, выдерживают при комнатной температуре 20 минут, промывают водопроводной водой и физиологическим раствором, затем дистиллированной водой. Мазки подсушивают на воздухе, наносят на них небольшую каплю смеси, состоящей из 9 частей глицерина и 1 части 0,05 М фосфатного буфера, накрывают покровным стеклом, прсматривают в люминесцентном микроскопе. Для контроля готовят 2−3 мазка одного из диагностических штаммов лептоспир и окрашивают их параллельно с мазками из патологического материала 5,6.

Окрашенные флюоресцирующим глобулином лептоспиры имеют зеленоватое, не сияющее, свечение всей поверхности микроба (в отличие от контурного сияющего свечения микробов других видов). В препарате лептоспиры сохраняют свою форму, просматриваются отдельные вторичные (первичные не видны) завитки спирали. Характерные для живых лептоспир булавовидные утолщения на концах, наблюдаемые при темнопольной микроскопии, не видны 6.

Результаты люминесцентной микроскопии учитывают на основании обнаружения морфологически характерных лептоспир и интенсивности их свечения, оцениваемой в крестах: (++++) — четкое зеленоватое свечение; (+++) — умеренное зеленоватое свечение; (+) — зеленоватые «тени»; (-) — нет морфологических характерных форм для лептоспир 2.

Диагноз на лептоспироз считают установленным при обнаружении в патологическом материале микробов с морфологией, типичной для лептоспир, с интенсивностью свечения не менее чем два креста 2.

Бактериологическое исследование. В 5−7 пробирок с питательной средой для лептоспир засевают по 3−5 капель из каждого патологического материала, в котором предварительной микроскопией обнаружены лептоспиры. Из почек, легких, печени посевы проводят пастеровской пипеткой, которой отбирают кусочки величной с просяное зерно с поверхности органов после предварительного прижигания их шпателем. Посевы инкубируют при 26−28°С. Наличие роста выявляют микроскопией в «темном поле» раздавленных капель, которые готовят из всех пробирок начиная с 10 дня до 90 дня культивирования. Серогрупповую принадлежность выделенных лептоспир определяют в перекрестной РМА с групповыми агглютинирующими сыворотками, серовариантную — в реакции иммуноадсорбции или РМА с моноклональными сыворотками. Групповые агглютинирующие лептоспирозные сыворотки выпускают в наборе к лептоспирам 13 серогрупп: Grippotyphosa, Pomona, Icterohaemorrhagiae, Canicola, Tarassovi, Bataviae, Hebdomadis, Australis, Autumnalis, Pyrogenes, Ballum, Cynopteri, Yavanica 8.

Типируемую культуру 5−10- суточного роста, содержащую не менее 50 лептоспир в поле зрения микроскопа и не имеющую признаков агглютинации и лизиса, проверяют в РМАЛ с каждой из 13 групповых агглютинирующих сывороток. Перед постановкой реакции сыворотку растворяют дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке, а затем готовят двукратные разведения физиологическим раствором по схеме. Затем в лунках смешивают 0,1 мл типируемой культуры лептоспир с равным объемом каждого разведения сыворотки. После тщательного перемешивания пластины помещают на один час в термостат при 37 °C. Результаты РМА оценивают в «темном поле» микроскопа по четырех бальной системе: (++++) — аглютинированы и лизированы 100% лептоспир; (+++) — аглютинированы и лизированы 75% лептоспир; (++) — аглютинированны и лизированы 50% лептоспир; (+) — аглютинированы и лизированы 25% лептоспир; (-) — аглютинации лизиса нет 8.

Испытуемую культуру относят к серологической группе лептоспир гомологичной наименованию сыворотки, с которой она дает реакцию на 2−4 креста до 50−100% гомологичного титра 9.

Выделение типичной культуры лептоспир из патологического материала дает основание для установления диагноза 9.

Биологическое исследование проводят для выделения и очистки культур лептоспир, определение их вирулентности. Патологический материал (моча, кровь, суспензии из органов от больных или погибших животных) вводят в брюшную полость двум 8−10-дневным крольчатам в дозе 2−2,5 мл или двум 3−4 недельного возраста золотистым хомячкам в дозе 0,5−1мл. При отсутствие гибели животных убивают: одно на 4−5-й день, другое на 15−16-й день после заражения. Из каждого органа и крови павших или убитых зверьков делают высевы в 3−4 пробирки с питательной средой для лептоспир. Одновременно микроскопически исследуют в «темном поле» препараты из транссудатов грудной и брюшной полостей, околосердечной сумки, мочи из мочевого пузыря, а также из почек, печени, легких обоих зверьков, а сыворотку крови животного, убитого через 14−16 дней после заражения, исследуют и в РМА. Микроскопическое обнаружение лептоспирв патологическом материале зараженных зверьков или положительная РМА в разведении их сыворотки 1:10 и выше дают основания для заключения о положительных результатах биопробы, и диагноз на лептоспироз считают установленным 7. кормовой перезаражение инфекционный лептоспироз Серологическое исследование предусматривает постановку РМА и РА с сыворотками крови животных при подозрении на лептоспироз, а также для систематического контроля эпизоотической ситуации в племенных хозяйствах. С этой целью в племенных хозяйствах исследуют сыворотки крови всех производителей и не менее 10% по РМА и 15% по РА коров, нетелей, свиноматок и кобыл один раз в год; на племенных предприятиях (станциях, пунктах) искусственного осеменения всех производителей — 2 раза в год; перед вводом и выводом для племенных целей в группах до 25 голов — всех животных, до 100 голов — не менее 25 животных, в больших группах — не менее 25% животных по РМА и 35% животных по РА. При постановке РМА сыворотку разводят физиологическим раствором 1:50, 1:250, 1:1250. Антигенами служат живые музейные культуры лептоспир 4−6-й серогрупп, которые постоянно выращивают в диагностических лабораториях. Реакцию ставят на плексигласовых пластинках. Разведеную сыворотку разливают по 0,1 мл в 3 лунки начиная с большего разведения. Каждую разведенную сыворотку разливают в отдельный ряд, число которых определяется количеством антигенов, используемых для постановки диагноза. Каждую культуру — антиген вносят по 0,1мл в лунки с разным разведением сыворотки. Затем пластины встряхивают и ставят в термостат на 1час при 37*С. Контролем служит смесь 0,1 мл каждой культуры — антигена с равным объемом физраствора 7.

Реакцию учитывают посредством обнаружения склеивания лептоспир и образования «паучков» при микроскопии в «темном поле» капель из каждой лунки, которые исследуют от большого разведения к меньшему. Результаты реакции оценивают в крестах по пятибальной системе: (++++) — агглютинированно 100% лептоспир; (+++) — агглютинированно 75% лептоспир; (++) — агглютинированно 50% лептоспир; (+) — агглютинированно 25% лептоспир; (-) — агглютинация отсутствует. Положительной считают реакцию, оцененую не менее чем на два креста при отсутствии агглютинации в контроле. При повторном исследовании сывороток крови реакцию ставят в тех же разведениях 5,7. Сыворотку крови от вакцинированных животных свиней и овец с диагностической целью можно исследовать на лептоспироз спустя 2 месяца, а крупного рогатого скота — 3 месяца после прививки 6.

Диагноз на лептоспироз считают установленным при обнаружении нарастания титра антител у исследуемого животного в 5 и более раз при повторном исследовании сыворотки крови или при выявлении специфических антител в диагностических титрах более чем у 25% однократно обследуемых животных 7,8.

Гистологическое исследование. Для гистологического исследований препараты окрашивают гематоксилин-эозином, для обнаружения лептоспир — методом импрегнации серебром по Левадити 8.

При остром лептоспирозе гистологические изменения в печени характеризуются отечностью и разрыхлением волокон междольковой соединительной ткани, набуханием и десквамации звезчатых эндотелиоцитов, наличием ареактивных некрозов, зернистой и жировой дистрофией печеночных клеток; в почках устанавливают зернистую дистрофию и гемосидероз эпителияизвитых канальцев, прлифирацию эндотелия капилляров клубочков. При хроническом лептоспирозе и лептоспироносительстве выявляют в печени инфильтарацию интерстициальной ткани лимфоидными и гистиоцитарными клетками, иногда регистрируют мелкие очажки внутридольковых клеточных скоплений; в почках — пролифирацию лимфоидно-макрофагальных клеток с атрофией паренхиматозных элементов вокруг клубочков, в межканальцевой и особенно периваскулярной соединительной ткани, мукоидное и фибриноидное набухание стенок сосудов микроциркуляторного русла 8,10.

Диагноз считают установленным при обнаружении лептоспир в гистологических препаратах почек или печени, импрегнированных серебром по Левадити 10.