Идентификация патогенных микроорганизмов с использованием молекулярных методов

В большинстве случаев при анализе симптомов поражения мы имеем предположения о том, какой патогенный организм следует искать. Так, если мы видим поражение стебля томата или картофеля, покрытое мелкими черными точечными склероциями, то это, скорее всего, Colletotrichum coccodes. В этом случае достаточно взять готовую пару праймеров или пару праймеров и зонд (тест-систему) для этого патогена, выделить ДНК из пораженной ткани и провести диагностическую ПЦР. Если результат положительный — то действительно, это Colletotrichum coccodes. Если отрицательный — придется выделять возбудителя болезни в чистую культуру и определять.

Представим более сложный вариант — например, некроз на листе томата. Исследование во влажной камере показало присутствие Phytophthora infestans. Но мы предполагаем, что там же присутствуют и какие-то другие грибы (видны гифы, непохожие на Phytophthora infestans). Если это сапротрофные виды, то ничего страшного нет. Но если это фитопатогены, например Altemaria или Colletotrichum, то неправильный подбор фунгицидов (многие фунгициды против Phytophthora infestans не действуют на аскомицетов) приведет к развитию заболевания и большим потерям урожая. Можно, конечно, использовать смесь фунгицидов. Однако использование смесей дорого, к тому же в смеси активность отдельных фунгицидов часто снижается.

В таком случае необходимо проводить диагностику с тест-системами на все предполагаемые объекты. Если при использовании тест-систем на Altemaria и Colletotrichum результат отрицательный — следует попробовать тест-системы на виды, встречающиеся на томате с похожими симптомами (в данном случае это могут быть грибы родов Fusarium, Botritis и др.). С помощью ПЦР все анализы можно сделать за один день.

Задача поиска известных фитопатогенных объектов актуальна не только для поиска возможных возбудителей болезней на поле или в саду. Она имеет и другие приложения, например:

— поиск карантинных организмов в партиях семенного материала, ввозимого на территорию страны;

исследование проб аэрозоля воздуха, либо проб воды на наличие пропагул фитопатогенных (или карантинных) организмов. Присутствие в воздухе спор фитопатогенных грибов может свидетельствовать о скором начале эпифитотии;

— сертификация семенного материала, производимого семеноводческими компаниями;

выявление токсинообразующих видов на продовольственном материале. Особенно актуальна эта проблема для зерна.

Ограничением использования диагностики молекулярными методами является то обстоятельство, что для многих фитопатогенов пока не создано тест-систем. С другой стороны, даже успешно работающие в Европе или в Америке тест-системы могут не дать желаемого результата при использовании в других странах, например в России. Особенно это характерно для быстро мутирующих вирусов или бактерий: тест-система может не узнавать некоторые их штаммы, в результате чего мы получаем ложноотрицательный результат. Может быть и обратная ситуация, когда тест-система, разработанная для одного вида, дает положительные результаты для близкородственных видов, т. е. мы имеем ложноположительные результаты. Последнее особенно неприятно при выявлении карантинных организмов. Поэтому все тест-системы должны проходить обязательную проверку на штаммах из разных регионов и на близкородственных видах.

В случае, когда для интересующего вида не существует разработанных и апробированных тест-систем, остается только создавать их самостоятельно. Однако создание тест-систем и их проверка — занятие сложное и длительное, доступное только для хорошо оборудованных научных учреждений с квалифицированным штатом. Поэтому в данном учебнике мы не будем касаться методов разработки тест-систем, а остановимся только па описании разнообразных методов идентификации фитопатогенных организмов.

Для идентификации фитопатогенных объектов в настоящее время используется широкий арсенал различных методов. Среди них: электронная микроскопия, газожидкостная хроматография, изоферментный анализ, двумерный электрофорез, анализ вторичных метаболитов и т. д. Однако большая часть этих методов используется либо для очень узкого круга патогенов, либо исключительно в научных целях, так как отличается высокой ценой. В практике широкое использование получили методы идентификации, основанные на структуре ДНК (или РНК — для вирусов) и на взаимодействии антиген — антитело.