Кристаллохимия и морфогенезис природных и биомиметических апатит-(CaF) — органических композитов

Актуальность исследования. Изучение особенностей строения и образования вещества биологических твердых тканей имеет фундаментальное значение для выяснения механизмов коэволюции минеральной и органической материи, приведших к формированию биосферы, которая стала мощным фактором, влияющим на геохимические процессы в литосфере, гидросфере и атмосфере (Вернадский, 1926, 1935; Самойлов, 1929; Лапо, 1987; Юшкин, 1988, 1993,2002 и др.). Исследования в этой области открывают новые возможности для решения широкого круга геологических задач, связанных с разработкой методов биостратиграфического картирования, поиском и оценкой перспективности месторождений полезных ископаемых. Кроме того, результаты этих исследований широко применяются при создании современных биосовместимых материалов медицинского назначения.

Образующиеся в живых организмах физиогенные органо-миперальные композиты (кости, зубы, иголки, скорлупа яиц, экзоскелеты моллюсков и др.) характеризуются особой иерархической самоорганизующейся структурой (Кораго, 1992; Landis et al., 1996; Glimcher, 2006). Согласно современным представлениям, вещество твердых тканей ряда живых организмов (морских ежей, моллюсков, кораллов, фораминифер и др.) представляет собой особый тип наноструктурированных материалов, называемых мезокристаллами (Colfen, Antonietti, 2005, 2008; Colfen, Mann, 2003; Colfen, 2008; Colfen, Yu, 2005; Niederberger, Colfen, 2006; Coelfen, Antonietti, 2008; Zhou, Brien, 2008; Song, Colfen, 2009). Основным минеральным компонентом твердых тканей костей и зубов человека и многих живых организмов является нестехиометрический по составу карбонатсодержащий апатит-(СаОН), который, в процессе фоссилизации превращается в карбонатсодержащий апатит-(СаР) (Elliott, 1994, 2002; Frank-Kamenetskaya, 2008 и др.). В ряде случаев карбонатсодержащий anaraT-(CaF) может составлять основу твердых тканей живых организмов, примером этого является эмалеподобная ткань зубов акулы и рыбы-кабана.

Вещество биологических твердых тканей, в том числе кристаллохимические особенности апатита биогенного происхождения, исследованы недостаточно. Известно, что особенности зарождения и роста апатита в биологических системах контролируются не только значениями температуры, давления и pH среды, но и спецификой присутствующего органического вещества, которое существенно влияет и на структуру агрегата в целом. Механизм этого сложного биокосного взаимодействия, а также всего процесса биоминерализации, в настоящее время являются дискуссионным. Предложено несколько феноменологических моделей формирования твердых тканей живых организмов (Кораго, 1992; Landis et al., 1996; Gross, Berndt, 2002; Glimcher, 2006), которые, однако, не вполне объясняют ключевые закономерности этого сложного процесса. В последние годы существенный прогресс в изучении механизмов биоминерализации достигнут при моделировании образования апатито-органических агрегатов в условиях, имитирующих биологический процесс при биомиметическом синтезе (Kniep, Busch, 1996; Kniep, Simon, 2006, 2008). Проведение новых исследований в данной области имеет как научное, так и практическое значение.

Цель и задачи исследований.

Цель работы — изучение кристаллохимии и морфогенезиса вещества биологических твердых тканей на основе апатита.

Основные задачи.

1. Изучение морфологии, нанокомпозитной структуры и состава вещества фоссилизованных твердых тканей элементов ротового аппарата конодонтов.

2. Синтез биомиметических апатит-(СаР)-желатиновых композитов — аналогов вещества биологических твердых тканей.

3. Изучение морфогенезиса апатит-(СаР) — желатиновых композитов.

4. Выявление влияния карбонат-иона на морфогенетические особенности, нанокомпозитную структуру и изоморфизм апатита синтезированных композитов.

Научная новизна. Изучена кристаллохимия и морфогенезис природных и биомиметических апатиг-(СаР)-органических композитов. Впервые показано, что вещество альбидной и гиалиновой тканей элементов ротового аппарата конодонтов представляет собой полностью или частично наноструктурированный материал (мезокристалл). Методом монокристального рентгеноструктурного анализа проведено уточнение кристаллической структуры апатита биогенного происхождения (альбидной ткани зубца конодонтового элемента). Синтезированы карбоиатсодержащие апатит-(СаР)-желатиновые композиты, являющиеся аналогами вещества ряда биологических твердых тканей. Экспериментально изучена начальная стадия образования апатит-(СаР)-желатиновых нанокомпозитов. Выявлено, что присутствие карбонат-иона в среде кристаллизации существенно влияет на морфологию и внутреннее строение апатит-(СаР)-желатиновых нанокомпозитов. Показано, что вхождение карбонат-иона в структуру апатита-(СаР) приводит к образованию трех серий твердых растворов, различающихся по нестехиометрии и природе ее возникновения.

Практическое значение. Новые данные о структуре и составе вещества твердых тканей конодонтов можно использовать для уточнения классификации твердых тканей конодонтовых элементов, реконструкции процесса их образования и роста, а также таксономической принадлежности этих организмов. Результаты биомиметического синтеза аналогов вещества биологических твердых тканей имеют важное значение для создания биосовместимых материалов медицинского назначения. Результаты проведенных исследований используются в лекционных курсах «Кристаллическое вещество в живых организмах» и «Биоминералогия и органическая минералогия» (пилотный проект «Молекулярная геохимия и биогеохимия») для студентов геологического факультета СПбГУ, а также в курсе «Основы биологической минералогии» для студентов кафедры геологии и геоэкологии географического факультета РГПУ им. А. И. Герцена.

Объекты и методы исследования. Фактическую основу диссертации составляют результаты изучения состава, строения и морфологических особенностей вещества природных и синтетических апатито-оргапических композитов. Было исследовано вещество твердых тканей S-элементов ротового аппарата конодонтов рода Polygnathus (отряда Ozarkodinida) из девонских отложений в районе озера Ильмень (Новгородская область), характеризующееся хорошей сохранностью твердых тканей. Образцы были получены от к.г.-м.н. А. В. Журавлева (ВНИГРИ, Санкт-Петербург). Кроме того, методом встречной диффузии в желатиновом геле были синтезированы биомиметические апатит-(СаР)-желатиновые композиты. Кристаллизацию осуществляли в U-образной трубке-ячейке, в колена которой помещали растворы реагентов, разделенные цилиндрической колонкой из желатинового геля (концентрация желатина 10 мас.%). Колена ячейки заполняли растворами СаСЬ (0.1333 М) и Na2HP04, ЫагСОз, NaF. Исходное соотношение молярных концентраций СаСЬ: Na2HP04: ЫагСОзгЫаР = 5:5:х:1, значения х варьировали в диапазоне от 0 до 9 (шаг 0.5, 1). В качестве буфера для исходных растворов использовали трис-(гидроксиметил)-метиламинрН, используя 2 М раствор НС1, доводили до значения 7.40(2), которое близко к таковому в плазме крови человека. Начальное значение рН желатинового геля составляло 3.0(2). Синтез проводили в течение 3−21 суток при температуре 25 °C. В ходе эксперимента в желатиновом геле наблюдалось образование пространственно разделенных областей (колец Лизеганга С, М, Р) в которых образование продуктов реакции происходило наиболее интенсивно. Детальное изучение вещества природных и синтетических апатито-органических композитов было проведено методами порошковой и монокристальной рентгенографии, ИКи КР-спектроскопии, различными методами химического анализа (атомно-эмиссионная спектроскопия с индуктивно-связанной плазмой, потенциометрияметод сожжения, комбинированный с горячей газовой экстракциейэнергодисперсионный рентгеноспектральный микроанализ (ЭДС)), а также гистохимическим методом. Для определения содержания карбонат-ионов и желатина в синтетических биомиметических композитах впервые была использована методика, основанная на расчете их концентраций по данным о соотношении и содержании углерода и азота в чистом желатине и в исследуемом образце. Для однозначного определения присутствия в апатите композита гидрофосфат-иона и позиции карбонат-иона была разработана методика, основанная на совместном использовании ИК-и КР-спектровполучены зависимости для оценки количества карбонат-иона. Изучение морфологии и иерархической структуры природных и синтетических композитов проводили с привлечением широкого спектра различных методов сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии (СЭМ, ПЭМ). При детальном исследовании структуры агрегатов на нанометровом уровне применяли методы высокоразрешающей ПЭМ (ВР-ПЭМ) и электронной дифракции (ЭД). Приготовление ультратонких срезов для ПЭМ исследований осуществляли ультрамикротомическим методом и методом ионного травления с использованием фокусированного ионного пучка. При изучении электрических свойств частиц синтетических композитов, а также для определения их толщины привлекали метод электронной голографии. При обработке экспериментальных данных использовали статистические методы (метод анализа главных компонент, кластерный и регрессионный анализы).

Защищаемые положения.

1 .Нанокомпозитная структура вещества исследованных твердых тканей конодонтовых элементов различается по степени разориентировки кристаллитов карбонатсодержащего апатита В-типа, содержанию органической компоненты и микроэлементов, а также размеру и распределению пор. Вещество альбидной и гиалиновой ткани представляет собой полностью или частично наноструктурированный материал (мезокристалл).

2.Формирование биомиметических апатит-(СаР)-желатиновых нанокомпозитов начинается с образования мозаичной структуры из нанопластинок апатита вдоль макромолекул желатина, проходит стадию образования упорядоченных гексагонально-призматических композитных частиц (мезокристаллов), сопровождающуюся формированием сверхструктуры нанокомпозита и его внутреннего электрического поля, и заканчивается образованием сферолитов (путем расщепления частиц через серию гантелеобразных форм).

3.С увеличением концентрации карбонат-ионов в среде кристаллизации их содержание в апатите растет (за счет замещения фосфат-ионов), что приводит к увеличению числа вакансий в позициях кальция и фтора. Параллельно разориентировка кристаллитов апатита увеличивается, их размеры уменьшаются, призматические грани мезокристаллов замещаются округлыми поверхностями, характер расщепления частиц изменяется.

4.Синтезированные апатит-(СаР)-желатиновые агрегаты по нанокомпозитной структуре, содержанию белковой компоненты и особенностям изоморфизма апатита являются аналогами вещества твердых тканей ряда современных и ископаемых организмов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на международных и российских конференциях: «Федоровские сессии» (Санкт-Петербург, 2006, 2008), «The llth European Conference on Solid State Chemistry» (Кан, Франция, 2007), «CRTD Summer Conference on Regenerative Medicine» (Дрезден, Германия, 2007), «3nd Bilateral Workshop MPI CPfS and K09 University» (Стамбул, Турция, 2008), «Минералогические музеи» (Санкт-Петербург, 2008), «БЮМ1НЕРАЛОГ1Я — 2008» (Луцк, Украина, 2008), «III Российское совещание по органической минералогии» (Сыктывкар, 2009). По теме диссертации по приглашению проф. В. Депмайера в 2008 г была прочитана лекция в Университете им. Христиана Альбрехта (Киль, Германия).

По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 7 статей (из них 6 в журналах, входящих в список ВАК).

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (грант № 06−05- 65 165) и Германского исследовательского фонда (DFG-Biomineralisation: KN 150/14−1 и BR 306/34−1). Отдельные разделы работы отмечены дипломами Российского минералогического общества: диплом победителя конкурса докладов молодых ученых России на международной конференции «Федоровская сессия» (октябрь, 2008) — диплом первой степени в конкурсе научных работ молодых ученых России (октябрь, 2009).

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения и списка литературы. Общий объем диссертации 209 страниц, включая 105 рисунков, 17 таблиц и библиографию из 371 наименований.

Результаты исследования твердых тканей S-элемента конодонтов рода Polygnathus (отряд Ozarkodinida) из девонских отложений вблизи озера Ильмень микроскопическими методами позволили выявить существенные отличия в их структуре, обусловленные различием размера и упорядоченности кристаллитов и пор, а также распределения органического вещества (Россеева и др., 2009; Frank~K.amenetskaya, Rosseeva et al., 2008).

На снимках конодонтовых элементов, полученных с помощью оптического (светового) микроскопа (рис. 3.2, 4.1а) хорошо видно, что зубцы в отраженном свете непрозрачны и имеют белую окраску, т. е. состоят из так называемой альбидной ткани, при этом «корневые» части зубцов глубоко уходят в стержни. На срезах некоторых элементов (рис. 4.1а) хорошо видно, что в стрежне также присутствуют более мелкие зубцы из альбидной ткани, не выходящие на поверхность. Таким образом, создается впечатление, что в стержне набшодается частичное смыкание корневых частей зубцов с образованием прерывистого тяжа из альбидной ткани. Сами стержни, сложенные гиалиновой тканью, в отраженном свете прозрачные или немного матовые и имеют окраску от светло-желтой до светло-коричневой (рис. 3.2, 4.1а).

3 ¦ t- / • - J * г1 ' / 0 • б.

200 ?7m 100 (jm.

Рис. 4.1. Изображение среза конодонтового 5-элемента, (а) оптическая микроскопия, (б) СЭМ.

В в.

20 рт ж л.

Рис, 4.2. (а) СЭМ изображение зубца конодонтового элемента. Рамками выделены участки, изображенные на (в), (ж) и (л). На (г), (з), (м) показано соотношение размеров ширины и длины пор в тканях на рис. (в), (ж) и (л), соответственно. На (д), (и) и (н) показано соответствие распределения длины пор в тканях, изображенных на рис. (в), (ж) и (л) логнормальному закону (красная линия). На (е), (к) и (о) показано соответствие распределения ширины пор в тканях, изображенных на рис. (в), (ж) и (л) логнормальному закону (красная линия).

На СЭМ изображениях (рис. 4.16, 4.2а-в) видно, что центральная часть зубцов, состоящая из альбидной ткани, характеризуется наличием пор, форма которых близка к изометричной. В областях, близких к корневым частям зубцов, форма пор становится более удлиненной (рис. 4.26,ж, л). В центральной части зубца в целом наблюдается хаотичная ориентация пор, однако большинство пор вытянуты вдоль удлинения зубца (рис. 4.2.б, в). В пограничных зонах между альбидной и гиалиновой тканей ориентация пор (по направлению удлинения) совпадает с направлением распространения ламелей, при этом в интралламелярных зонах плотность пор максимальна (рис. 4.2.6, ж, л). Изучение характера распределения ширины и длины пор в различных частях зубцов показывает, что оно наиболее близко к логнормальному (рис. 4.2 д, е, и, к, н, о). При этом количество мелких пор значительно больше, чем крупных. Известно, что логнормальное распределение является типичным для большинства природных и синтетических пористых материалов (Zeman, Zydney, 1996; Shi, Brown, Ma, 2005; Tiryakioglu, 2007). Размеры пор в центральной части исследованного образца (рис.5) могут достигать длины до 10 мкм (средние значение 0.78 мкм) при ширине до 3 мкм (средние значение 0.47 мкм), в корневой части зубцов длина и ширина пор достигает 5 и 2 мкм соответственно (средние значения 0.57 и 0.3 мкм), в латеральной части зубца в области, являющейся переходной к гиалиновой ткани, длина пор достигает 2 мкм (средние значение 0.46 мкм), а ширина — 0.9 мкм (средние значение 0.24 мкм). В целом, полученные значения размеров пор характерны для альбидной ткани конодонтовых элементов (Barnes et al., 1973; Kemp, Nicoll, 1997; Donoghue, 1998). Таким образом, распределение пор по размерам в области зубца подчиняется логнормальному распределению. Размеры пор закономерно уменьшаются при переходе от центральной к корневой части. Параллельно поры начинают концентрироваться в интерламелярных областях, т. е. близкое к хаотичному распределение пор сменяется более упорядоченным (рис. 4.2).

На СЭМ снимках, стрежневой части элемента (рис. 4.3) видно, что гиалиновая ткань имеет слоистое строение, при этом смежные слои разделены темными зонами (интерламелярное пространство), что обусловлено наличием в них пор или соединений, содержащих элементы с более низкими порядковыми номерами по сравнению с апатитом, например, органических веществ. Ширина слоев составляет порядка 2−3.5 мкм (рис. 4.3в). Считается, что слои отвечают периодам роста конодонтового элемента (Журавлев, 2002, 2005). В изученных конодонтовых элементах в гиалиновой ткани содержится более тридцати слоев (рис. 4.3 а). Переходная альбидно-гиалиновая область также имеет слоистое строение (рис. 4.3г, д). При этом четко выраженные слои в гиалиновой ткани (рис. 4.3б, в) продолжаются в переходной зоне (рис. 4.Зг, д). В альбидной ткани они становятся более размытыми и слабо различимыми (рис. 4.26). Интенсивная пористость и слоистость гиалиновой, альбидной и переходной тканей является косвенным подтверждением их внутреннего гистологического родства (Trotter et. al, 2007). В стержнях конодонтовых элементов, состоящих в основном из слоистой гиалиновой ткани, присутствуют также области альбидной ткани удлиненной зубоподобной формы (не выходящие на поверхность элемента) (рис. 4.1, 4.4), которые, вероятно, представляют собой зубцы конодонтовых элементов на ранней стадии роста конодонтов (Журавлев, 2002).

Рис. 4.3. СЭМ изображения гиалиновой (а-в) ткани и переходной альбидно-гиалиновой области (г, д) конодонтового элемента. а б.

20 рт 20 рт.

Рис. 4,4. СЭМ изображения стержня конодонтового элемента (изображенного на рис. 4.1), состоящих из слоистой гиалиновой ткани, в которой присутствуют области альбидной ткани удлиненной зубоподобной формы (показаны стрелкой).

На СЭМ изображениях конодонтовых элементов с поперечными (рис. 4.5, 4.7) и продольными (рис. 4.6) сколами зубцов хорошо заметно не только слоистое строение гиалиновой ткани (рис. 4.5 д, е, 4.6 л, н-у, 4.7д-е), но и хорошо различимы отдельные структурные единицы — кристаллиты, ориентация которых практически совпадает с направлением роста зубца (рис4.5 д, е.). Сколы альбидной ткани более гладкие (рис. 4.5 В, 4.6 ж-и, 4.7 г, 4.8а), однако при высоком разрешении выявляется ее шероховатость (рис. 4.8б, в) (особенно в областях, расположенных ближе к поверхности зубцов (рис. 4.8в)), что, вероятно, обусловлено выходом на поверхность сколов кристаллитов нонометровых размеров, упакованных более плотно, чем в гиалиновой ткани. На рис. 4.5ж-и и 4.6 и, м очень хорошо проявляется структура переходной альбидно-гиалиновой области. Для нее характерно наличие хорошо различимой слоистой структуры (свойственной для гиалиновой ткани), а также пористость и относительная гладкость поверхности (свойственные для альбидной ткани). Гиалиновая ткань вблизи основания (базальной части) конодонтовых элементов также имеет слоистое строение (рис. 4.6р-у, 4.7д, е,), однако интраламлеллярное пространство в ней гораздо шире (рис. 4.7д, е, 4.9 а-в). На изображениях, полученных с помощью ВЭЕ-детектора обратно рассеянных электронов, хорошо видна внутренняя неоднородность этой ткани, проявляющаяся в присутствии темных участков (рис. 4.9г), вероятно, обогащенных органическим веществом. а и 200 * б 9 1, V. Ч # - 20*0 мт 50 мт в.

20 г. а «Г * - -л — ЧД, ..: -* V «' '-А 5 |лп е V * ^ V 2 рт ж ж Л •. ч» т 3 & ' ^ Д. Л ' • ЛИ ^ ^ И 2 мт.

К л 5 рт м 2 ¡-лт.

Рис. 4.5. (а) СЭМ изображение конодонтового элемента- (б) изображение элемента в световой микроскоп, на котором видны белые непрозрачные зубцы, состоящие из ал ьб ид ной ткани и прозрачные стержни из гиалиновой ткани- (в) СЭМ изображение скола зубца- (г) увеличенное изображение, видна пористая альбидная и слоистая гиалиновая ткани (в) — (д, е) СЭМ изображение слоистой гиалиновой ткани, видны отдельны кристаллиты- (ж-и) СЭМ изображение переходной области между гиалиновой и альбидной тканями- (к-м) морфология поверхности в области основания зубца.

Рис. 4.6 Изображения конодонтового элемента в световой микроскоп, на котором видны белые непрозрачные зубцы, состоящие из альбидной ткани и прозрачные стержни из гиалиновой ткани: (а, б) -вид сбоку,(в)-вид сверху- (г) СЭМ изображение (а) — (д) СЭМ изображение (в) — (д) СЭМ изображение (б) — (ж-и) СЭМ изображение вершины зубца, состоящего из пористой альбидной ткани- (к, м) СЭМ изображение переходной области между альбидной и гиалиновой тканями- (л, н-п) СЭМ изображение слоистой гиалиновой ткани- (р-у) СЭМ изображение слоистой гиалиновой ткани в области основания стержня.

Рис. 4,7. (а) изображение конодонтового элемента в световой микроскоп, на котором видны белые непрозрачные зубцы, состоящие из альбидной ткани и прозрачные стержни из гиалиновой ткани- (б) СЭМ изображение элемента — (в) СЭМ изображение скола зубца- (г) увеличенное изображение (в), видна пористая альбидная и ткань внешней каймы зубца (в) — (д, е) СЭМ изображение слоистой гиалиновой ткани в области основания стержня- (ж-и) морфология поверхности в области основания зубцов.

Рис. 4.8. СЭМ изображение скола зубца коноднтового элементы. При высоком увеличении (б, в) видно, что поверхность альбидной ткани шероховатая, при этом хорошо различимы плотноупакованные кристаллиты.

Рис. 4.9. СЭМ изображения среза конодонтового элемента в области основания (детектор BSE).

На СЭМ изображении поверхности зубца конодонтового элемента (рис. 4.9 а-в) четко видны удлиненные параллельные желобки, распространяющиеся вдоль его удлинения. Ближе к основанию зубца и на стержне элемента (в пространстве между зубцами) наблюдается изгибание этих желобков (рис. 4.5к-м, 4.7ж-и). На плоских стрежнях в области ближе к базальной части элемента явно выраженного рельефа поверхности не обнаружено, однако, поверхность в этой области шероховатая (рис. 4.7ж). Некоторые исследователи (Pierce & Langenheim, 1971; Conway Morris & Harper, 1988; Conway Morris, 1989; Zhuravlev, 1994; von Bitter & Norby, 1994; Zhuravlev, 2001, Журавлев, 2002) считают, что данная особенность морфологии поверхности конодонтовых элементов является следствием отпечатков клеток или клеточных агрегатов эпителиальной ткани, вырабатывавшей вещество конодонтового элемента. В качестве подтверждения этой модели исследователи, приводят доводы, что на поверхности некоторых фассилизованных скелетных останках других животных обнаружены сходные структуры {Smith, 1977; Blieck, 1982; Schultze, 1977, Fitz-Gerald, 1983, Mckay et al., 1994). Однако по нашему мнению формирования выявленных структурных образований на поверхности конодонтовых элементов может быть как следствие клеточных отпечатков, так и являться особенностями текстурирования вещества твердых тканей. Так, например, текстура схожая с так называемой стриатаностью (рис. 2.17) характерной для поверхности.

95 для зубцов конодонтов присутствует и на поверхности зубов акулы (рис. 4. Юг, д) и на иглах морского ежа (рис. 4.10е), а «регулярная» структура (рис. 2.17) очень похожа на строение поверхности эмали зубов млекопитающих в местах выхода эмалевых призм (рис.4Л0ж-з).

Рис. 4.10. (а) СЭМ изображение конодонтового элемента- (б-в) Морфология поверхновти зубцов конодонтового элемента- (г, д) зубы акулы (Rees, 1998,2000.) — (е) иголка морского ежа (Niederberger, Colfen, 2006) — (ж) поверхность эмали зуба человека (на сколе различимы эмалевые призмы) (Metealf, 2006) — (з) эмалевые призмы зубов человека (поперечный срез) (Busch et al., 2001).

Исследование одного из образцов конодонтовых элементов методом ПЭМ позволило выявить особенности структурирования различных твердых тканей конодотовых элементов вплоть до нанометрового уровня. Сравнение внутреннего строения вершин первого и второго зубцов переднего стержня (рис. 4.11) по данным СЭМ показало, что альбидная ткань второго (более крупного) зубца (рис.Зн, рис. 4.11 б) содержит большое количество пор, размеры которых достигают порядка одного микрометра и поэтому хорошо различимы на СЭМ изображении. Структура первого (более мелкого) зубца на микрометровом уровне более однородна (рис. 4.11а). Однако исследование ФИП-срезов методами ПЭМ выявило их внутреннюю неоднородность па нанометровом уровне, проявляющаяся в присутствии большого числа нано-пор, практически изометричной формы (рис. 4.12а, б). Изучение характера распределения размера пор ал ьб ид ной ткани вершин двух зубцов по данным ПЭМ показало, что оно наиболее близко к логнормальному (рис. 4.12в), что согласуется с результатами СЭМ исследования альбидной ткани других образцов (рис. 4.2). Размеры нанопор альбидной ткани в центральной части первого зубца в среднем составляют около 20 нм, во втором (более крупном) зубце — порядка 100 нм. В центральной части зубца, в целом, наблюдается хаотичное распределение нанопор, на фоне которого видны тяжи из нанопор, ориентированные преимущественно вдоль оси удлинения зубца (рис. 4.12а). Возможно, они образовались на месте фибрилл органического вещества. Дополнительно, в первом зубце обнаружены тяжи, параллельные оси удлинения зубцов, состоящие из пор более крупного размера (до 100 нм), благодаря наличию которых можно говорить о «слоистом» строении альбидной ткани (рис. 4.13).

Рис. 4.11. СЭМ изображения ФИП-срезов первого (а) и второго (б) зубцов переднего стержня конодонтового элемента.

Рис. 4.12. ПЭМ изображения ФИП-срезов первого (а, б) и второго (г) зубцов переднего стержня конодонтового элемента. (в, д) распределение пор по размерам (близкое к логнормальному) в областях показанных на рис. (б) и (г), соответвенно.

Рис. 4.13. ПЭМ изображение ФИП-среза первого зубца конодонтового элемента.

Строение ткани внешней каймы зубцов существенно отличается от структуры альбидной ткани их ядер (рис. 4.14). При этом граница между этими двумя типами ткани неровная и отчетливо различима на ПЭМ снимках (рис. 4.14а, б). Наличие этой каймы также отчетливо видно на СЭМ изображениях сколов зубцов (рис. 4.6 В, г- 4.7). Толщина каймы варьирует от нескольких десятков нанометров до одного микрона (рис. 4.14а). На ПЭМ и ВРПЭМ изображениях каймы первого зубца отчетливо видны более светлые удлиненные изогнутые жгутообразные образования, поперечное сечение которых составляет порядка 6−7 нм (рис. 4.14б, в). Предположительно, это могут быть минерализованные фибриллы (или их остатки) органического вещества ткани. Подобные структурные образования, представляющие собой микрофибрилы желатина, нами были выявлены на ПЭМ снимках синтезированных нами апатит-(СаР)-желати новых композитов (рис. 2.22, 6.7, 6.17).

Рис. 4.14. ПЭМ изображение ФИП-среза первого зубца конодонтового элемента. На (а) и б) пунктирной линией выделена граница пористой альбидной ткани с внешней каймой. в) увеличенная область ткани внешней каймы, на которой отчетливо видны светлые удлиненные изогнутые жгутообразные образования, поперечное сечение которых составляет порядка 6−7 нм (предположительно минерализованные фибриллы органического вещества).

Альбидная ткань центральной части зубцов проявляет дифракционные свойства, характерные для монокристалла, что хорошо видно по точечным электронограммам (рис. 4.15), Дифракционные картины, полученные от различных более узких областей центральной части зубца (уменьшали диаметр области съемки) идентичны (рис. 4.16). Отражения на всех «монокристальных» дифракционных картинах индицируются с использованием параметров гексагональной элементарной ячейки апатита. При этом ось с апатита параллельна оси роста и удлинения зубца (ось Ь перпендикулярна поверхности). На ПЭМ изображениях высокого разрешения, полученных от альбидной ткани зубцов (рис. 4.17), вдоль оси зоны [201] (рис. 4.166,г) расстояние между проекциями атомных плоскостей апатита составляет 0.81 нм (рис. 4.17а, в), что соответствует межплоскостному расстоянию (001) апатита. Таким образом, альбидная ткань представляет собой особый тип наноструктур иро ванных пористых материалов, проявляющих дифракционные свойства, характерные для монокристалла. В настоящее время известно большое число как природных, так и синтетических аналогов данного типа материалов, получивших название «пористых монокристаллов» (Li, Estroff, 2007; Ludwigs et al., 2006; Park, Meldrum, 2002,2004; Zhou, O’Brien, 2008; Colfen, Antonietti, 2008). Как и эти материалы, исследуемая альбидная ткань представляет собой иерархическую структуру, построенную из нанокристаллов, имеющих одинаковую кристаллографическую ориентацию и содержит частично упорядоченные ассоциаты из нанопор, которые, вероятно, образовались на месте фибрилл органического вещества.

Рис. 4.15. ПЭМ изображения ФИП-срезов первого (а) и второго (б) зубцов переднего стержня конодонтового элемента и соответствующие им индицированные картины электронной дифракции.

Рис. 4.16. ПЭМ изображения участков ФИП-срезов первого (а) и второго (г) зубцов конодонтового элемента. (б, в, д) индицированные картины электронной дифракции, полученные от областей 1 и 2 (па рис. (а)) и рис. (г), соответственно.

Рис. 4.17. ВР-ПЭМ изображения апатита альбидной ткани участков ФИП-срезов первого (а) и второго (в) зубцов переднего стержня конодонтового элемента, и соответствующие им индицированные дифракционный картины, полученные фурье-преобразованием (РРТ-изображения).

В области каймы верхней части зубцов дифракционная картина резко меняется и представляет собой систему колец, содержащих отдельные точки различной интенсивности (рис. 4.18), что характерно для поликристаллических образований. Наиболее интенсивные рефлексы на электронограмме соответствуют межплоскостным расстояниям в структуре апатита 002, 030 и 02−2 (рис. 4.186). Толщина внешней поликристаллической каймы зубца, вблизи его основания гораздо больше по сравнению с вершиной и составляет несколько микрометров (рис. 4.19). Граница раздела между поликристаллической и монокристаллической пористой тканями четко различима на ПЭМ снимках (рис. 4.196,в). Размер кристаллитов апатита в кайме варьирует от нескольких единиц до нескольких десятков нанометров. В области расположенной на стержне конодонтового элемента толщина поликристаллической каймы составляет около 2 мкм (рис. 4.20а, г). На ВРПЭМ изображениях, полученных от внешней каймы ФИП-среза, расположенного на стержне элемента (рис. 4.21−4.23), видны различно ориентированные нанокристаллы апатита размером до 10 нм. Дифракционные картины, полученные от данных изображений путем быстрого Фурье-преобразования (FFT), имеют вид характерный для поликристаллических апатитовых агрегатов и представляет собой систему колец, содержащих отдельные точки различной интенсивности. Сопоставление FFT-изображений полученных от различных частей ВРПЭМ снимков (рис. 4.21 г, е, з- 4.22 г, е, з) показывает, что они существенно различаются, что является следствием различной ориентировки кристаллитов апатита в данной ткани. На реконструированных ВР-ПЭМ изображениях (от рис. 4.22а), полученным после Фурье-фильтрации с выделением рефлексов с межплоскостными расстояниями от 0.16 до 0.46 нм (вставка в рис. 4.22и), а также только рефлексов (220) с d = 0.24нм (вставка в рис. 4.22к), отчетливо видно, что два домена разориентированых относительно друг друга примерно на 30° (рис. 4.22и, к). На фильтрованном ВРПЭМ изображении (от рис. 4.23а), с выделением рефлексов с межплоскостными расстояниями от 0.23 до 0.31 нм (вставка на рис. 4.23в) можно четко выделить четыре домена апатита (рис. 4.23в). Углы разориетировки между ними варьируют от 13 до 47°. Таким образом, во всех исследованных областях конодонтового элемента Polygnathus на поверхности присутствует особый поликристаллический слой ткани, состоящий из кристаллитов апатита (размером до нескольких десятков нанометров), которые существенно разориентированы. Толщина внешней каймы увеличивается при переходе от вершины зубца к стержню элемента. В области зубца в структуре этой ткани хорошо различимы минерализованные фибриллы органического вещества ткани. Ранее считалось, что на поверхности зубцов присутствует слой ламеллярной (гиалиновой ткани) (Donoghue, 1998; Журавлев, 2002,2005), однако наши исследования покачали, что структура ткани внешней каймы существенно отличается, от других типов тканей конодонтового элемента.

200 пт.

Рис. 4.18. ПЭМ изображение внешней каймы вершины первого зубца конодонтового элемента (а) и соответствующая ему картина электронной дифракции (б).

Рис. 4.19. (а) ПЭМ изображение ФИП-среза в области основания первого зубца конодонтового элемента — (б, в) увеличенные области (а), на которых отчетливо видна зона внешней каймы.

Рис. 4.20. (а, в) ПЭМ изображения верхней части ФИП-среза расположенного на стержне конодоитового элемента и соответствующие им картины электронной дифракции (б, г) (на ПЭМ изображеииях выделены области от которых были получены дифракционные карикы).

Рис. 4.21. (а) ВР-ПЭМ изображение области внешней каймы ФИП-среза расположенного на стержне конодоитового элемента- (в, д, ж) увеличенные области отмеченные на рис. (а) — (б, г, е, з) дифракционные картины, полученные Фурье-преобразованием изображений а, в, д, и ж, соответственно.

Рис. 4.22. (а) ВР-ПЭМ изображение области внешней каймы ФИТТ-среза расположенного па стержне конодонтового элемента- (в, д, ж) увеличенные области отмеченные на рис. (а) — (б, г, е, з) дифракционные картины, полученные Фурье-преобразованием изображений а, в, д, и ж, соответственно- (и, к) ВР-ПЭМ изображения, полученные от изображения на рис. (ж) в результате селективной фильтрации, ославляющей область рефлексов с 0.16−0.46 нм (вставка на (и)) и с≠ 0.24 нм.

Рис. 4.23. (а) ВР-ПЭМ изображение области внешней каймы ФИП-среза- (б) дифракционная картина, полученная Фурье-преобразованием изображения (а) — (в) ВР-ПЭМ изображение, полученное от изображения на рис. (а) в результате селективной фильтрации, ославляющей область рефлексов с с≠ 0.23−0.31 нм (вставка на (и)).

Па ПЭМ изображении ФИП-среза расположенного непосредственно на стержне вблизи основания зубца (рис. 4.24) отчетливо видна слоистая структура гиалиновой ткани.

Слои разделены светлыми пористыми тяжами, расположенными параллельно поверхности данной части элемента (оси роста). Ширина слоев варьирует от 500 до 1500 нм (рис. 4.24б). По данным ЭД в гиалиновой ткани существуют области размером до нескольких микрометров (рис. 4.25а), дающие дифракционную картину, характерную для монокристалла апатита (рис. 4.256, в). Кристаллиты апатита преимущественно ориентированы так, что кристаллографическая ось Ь перпендикулярна поверхности элемента (оси роста). В отличие от альбидной ткани пятна на электроннограммах более размыты, что указывает на менее упорядоченное распределение кристаллитов. При этом степень беспорядка в различных участках не одинакова: в области 1 меньше, чем в области 2 (на рис 4.25а). Более локальные ЭД исследования (зонд диаметром 500 нм) показали, что темные зоны (1 на рис. 4.25г) более упорядочены, чем светлые более пористые зоны (2 на рис. 4.25г). Применение ПЭМ высокого разрешения позволило найти в гиалиновой ткани (рис. 4.26) области с еще более сильными нарушениями монокристальной дифракционной картины (дополнительные рефлексы и диффузные кольца (рис. 4.26г, з)), что указывает на значительную разупорядоченность в распределении кристаллитов. Таким образом, гиалиновая ткань содержит области различного размера, отличающиеся по степени порядка. Преимущественно она состоит из достаточно крупных кристаллитов апатита (размеры которых достигают нескольких мкм), кристаллографическая ось с которых практически параллельна оси роста. При этом во всех областях присутствуют разориентированные нанокристаллы апатита. В наиболее разупорядоченых областях (дающих дифракционную картину для поликристаллов) хорошо различимы нанокристалы апатита размером до нескольких десятков нанометров. В целом, структура гиалиновой ткани менее упорядочена, чем альбидной, но существенно более, чем ткань внешней каймы.

То, что гиалиновая ткань менее упорядочена по сравнению с альбидной было обнаружено также при исследований ордовикских коиодонтовых элементов, А. Троттером с соавт. СПоНег, 2007). Эти данные совместно с нашими опровергают существовавшие ранее представления) о том, что гиалиновая ткань в конодонтовом элементе наиболее однородна и обладает максимальной степенью порядка. (Оопо^ие, 1998; Журавлев, 2002,2005).

Рис. 4.24. (а) ПЭМ изображение ФИП-среза, расположенного на стержне конодонтового элемента- (б) увеличенные области (а), на которой отчетливо видна слоистая структура гиалиновой ткани (стрелками показаны границы слоев).

Рис. 4.25.(а, г) ПЭМ изображения различных областей ФИП-среза расположенного на стержне конодонтового элемента и соответствующие им индицированные картины электронной дифракции (б, в, д, е) (на ПЭМ изображениях выделены области от которых были получены дифракционные картины).

Рис. 4.26. (а) ВР-ПЭМ изображение области гиалиновой ткани ФИП-среза расположенного на стержне конодонтового элемента- (в, д, ж) увеличенные области отмеченные на рис. (а) — {б, г, е, з) дифракционные картины, полученные Фурье-преобразованием изображений а, в, д, и ж, соответственно (стрелками отмечены дополнительные диффузные пятна и кольца).

На ПЭМ изображении ФИП-среза, расположенного непосредственно у основания зубца (рис. 4.19а) видно, что слоистость ткани в этой области менее выражена и более размыта по сравнению гиалиновой тканью стрежня элемента (рис. 4.24). Слои в нижней части среза (рис. 4.27) разделены светлыми пористыми прерывистыми тяжами, расположенными параллельно поверхности элемента (оси роста). Дополнительно, в отличие от гиалиновой ткани стержней, в исследуемой области в верхних слоях ткани (расположенных иод внешней поли кристаллической каймой) присутствует большое количество нанопор, практически изометричной формы (рис. 4.28а), которые как и и в альбидной ткани вершин зубцов распределены хаотично. По данным СЭМ аналогичный характер распределения пор наблюдается у основания зубцов и в других изученных элементов (рис. 4.2ж, л- 4.3г, д- 4.5 з, и). Таким образом, по характеру распределения пор данная область занимает промежуточное положение между альбидной и гиалиновой тканью. По данным ЭД в этой ткани существуют области размером до нескольких микрометров, дающие дифракционную картину, характерную для монокристалла апатита (рис. 4.28г), Незначительная размытость пятен свидетельствует о небольшой разупорядоченности кристаллитов. Аналогичная дифракционная картина характерна для наиболее упорядоченных областей гиалиновой ткани. Дополнительные хаотично распределенные пятна и диффузные кольца на электронограммах пограничной области, ранее выявленные в гиалиновой ткани стержней, не обнаружены. Таким образом, область конодонтового элемента у основания зубца можно рассматривать как переходную зону между альбидной и гиалиновой тканями, которая характеризуется промежуточной степенью упорядоченности. зубца.

Рис. 4.28.(а, в) ПЭМ изображения различных областей ФИП-среза расположенного у основания первого зубца конодонтового элемента и соответствующие им картины электронной дифракции (б, г).

Граница между альбидной и гиалиновой тканями размыта и плохо различима, поэтому определить ее точное положение часто невозможно. Троттер с соавторами предложили назвать (ТЮйег, 2006) этот промежуточный материал альбидно-гиалиновым. В.

Рис. 4.27. ПЭМ изображения ФИП-среза, расположенного у основания первого конодонтового элемента, иллюстрирующие слоистое строение ткани.

Г >" ¦ ¦

1000 тп общепринятой классификации тканей конодонтов (Оопо§ 1ше, 1998; Журавлев, 2002,2005) полного аналога данной ткани не существует. При этом, исследователи, как правило, отмечают, что граница между белым веществом и ламеллярной тканью резкая без переходов. По характеру и расположению в конодонтовом элементе наиболее близка к альбидно-гиалиновому материалу, так называемая, параламеллярная ткань (Журавлев, 2002,2005).

Как отмечалось ранее, кристаллографическая ось с кристаллитов апатита альбидной и гиалиновой тканей ориентированна преимущественно параллельно направлению роста элемента (ось Ь перпендикулярна).Сопоставление электрон нограмм от всех приготовленных ультратонких срезов в области первого зубца (полученных в одинаковых условиях съемки), показывает, что направление преимущественной ориентации оси Ь кристаллитов апатита при переходе от вершины зубца к стержню элементов меняется на 14.3° (рис. 4.29а, в). При этом при переходе от альбидной к гиалиновой ткани степень разупорядочивания кристаллитов апатита растет, что проявляется в увеличении размытости пятен на электроно грамм ах (рис. 4.29 в).

Рис. 4.29. (а) СЭМ изображение конодонтового элемента с приготовленными ФИП-срезами- (б) ПЭМ изображения ФИП-срезов- (в) картины электронной дифракции. Обозначения: (1) -ФИП-срез на вершине зубца- (2) — ФИП-срез у основания зубца- (3)-ФИП-срез на стержне у основания зубца.

Последовательные стадии растворения конодонтового элемента в солянокислом растворе ЭДТА (рН~2) показаны на рис. 4.29. На первом этапе растворяются краевые области стержня конодонтового элемента, состоящие из г и ал и новой ткани. Как отмечалось выше, ткань в этой части элемента очень пористая и состоит из мелких кристаллитов апатита, а также содержит большее количество органического вещества. Это способствует ее большой проницаемости и растворимости по сравнению с другими типами ткани. На следующем этапе происходит дальнейшее растворение гиалиновой ткани стержня. По мере ее растворения в структуре стержней четко становятся заметны удлиненные структурные элементы у основания стержней, состоящие из альбидной ткани, и, вероятно, на начальной стадии роста элемента, являвшиеся дополнительными зубцами. Подобные альбидные зубцы были обнаружены нами при изучении срезов конодотовых элементов методами световой и сканирующей элекгронной микроскопий (рис. 4.1, 4.4). На последнем этапе происходит растворение альбидной ткани зубцов конодонтового элемента. После растворения минеральной фазы остается органический остаток, форма которого в целом повторяет исходную морфологию элемента. При этом в области зубцов, состоящих из альбидной ткани, содержание органического вещества минимально (рис. 4.30). В целом, альбидная ткань на В8Е-снимках более светлая, но сравнению с гиалиновой тканью (рис. 4.3), что обусловливается меньшим содержанием в ней органических веществ.

200 fjm.

Рис. 4.30. Последовательные стадии растворения конодонтового элемента в солянокислом растворе ЭДТА (рН~2).

Таким образом, в ходе проведенного исследования твердых тканей S-элемента конодонтов рода Polygnathus (отряд Ozarkodinida) из девонских отложений вблизи озера Ильмень в структуре корональной части были идентифицированы и детально описаны три типа твердых тканей: альбидная, гиалиновая и ткань внешней каймы элемента. Все исследованные ткани характеризуются иерархической структурой и содержат нанокристаллы апатита, распределенные с различной степенью порядка. Кроме того различия в образцах проявляются в размерах и распределении пор, а также в наличии и характере локализации органического вещества.

Ткань внешней каймы дает дифракционную картину, характерную для поликристаллического вещества. Она состоит из апатита и вещества белковой природы и характеризуется нанокомпозитной структурой с максимальной степенью беспорядка в ориентации нанокристаллов апатита (до нескольких десятков нанометров), между которыми располагаются поры.

Расположенная в ядрах зубцов альбидная ткань дает дифракционную картину, характерную для монокристалла. Она представляет собой пористый монокристалл и характеризуется структурой с максимальной степенью порядка, которая состоит из нанокристаллов апатита, имеющих одинаковую кристаллографическую ориентацию (ось с параллельна оси роста (удлинению зубца)). Ткань содержит микропоры и частично упорядоченные ассоциаты из нанопор, которые, вероятно, образовались на месте фибрилл органического вещества. Наличие в альбидной ткани пор придает ей белую окраску в отраженном свете (Hass, 1941; Trotter et. al, 2007).

Составляющая основу стержней гиалиновая ткань характеризуется слоистой неоднородной нанокомпозитной структурой с промежуточной степенью порядка (менее упорядоченной, чем альбидная, но существенно более, чем ткань внешней каймы). Преимущественно она состоит из относительно крупных кристаллитов апатита (размеры достигают нескольких мкм), кристаллографическая ось с которых практически параллельна оси роста. При этом присутствуют нанокристаллы апатита, разориентировка которых в разных областях различна (угол между кристаллитами может достигать ~ 60°). Дифракционная картина меняется от монокристаллической, на которой присутствуют диффузные отражения, до поликристаллической. Поры в основном сконцентрированы в интраламелярном пространстве, а также между кристаллитами. От границы с альбидной тканью зубцов к прибазальной области элемента разупорядоченность и пористость ткани увеличивается. Граница между альбидной и гиалиновой тканями размыта и плохо различима, что может быть объяснено присутствием параламеллярной ткани (альбидно-гиалинового маериала). В отраженном свете эта область более прозрачна, чем альбидная, но значительно более матовая по сравнению с примыкающей к ней гиалиновой тканью (из-за наличия большего количества пор).

Согласно современным представлениям альбидная и гиалиновая ткани представляют собой особый тип наноструктурированных пористых материалов, называемых мезокристаллами (Coelfen, Antonietti, 2008; Zhou, Brien, 2008). В настоящее время известно большое число как природных, так и синтетических аналогов материалов данного типа. Мезокристаллы входят в состав всех твердых тканей костей и зубов живых организмов. Пористые монокристаллы, состоящие из кальцита (рис. 4.10е), образуются, например, в иголках морского ежа (Politi et. al., 2004; Sethman et al., 2005). Считается, что образование таких сложных структур, проявляющих дифракционные свойства, характерные для монокристаллов, возможно только за счет образования на начальной стадии роста (с участием клеток мягких тканей) аморфного карбоната кальция, который в последствии трансформируется в кальцит (Politi et. al., 2004; Colfen, Antonietti, 2008).

Полученные нами результаты изучения твердых тканей конодонтовых элементов рода Polygnathus (отряд Ozarkodinida) хорошо согласуются и существенно дополняют результаты исследования Тротерра с соавторами твердых тканей ордовикских конодонтов (Trotter, 2007). Дополнительно, в изученных нами конодонтовых элементах была выделено поликристаллическое вещество расположенной во внешней каймы, которое вероятно может быть начальным материалом, образующимся при формировании различных типов тканей. Также показано, что гиалиновая ткань является не полностью поликристаллической (как аналогичная ткань в ордовикских конодонтах (Trotter, 2007)). Выявленные нами, различия в строении твердых тканей изученных нами среднефранских конодонтов рода Polygnathus и ордовикских конодонтов описанных Троттером с соавторами (Trotter, 2007) могут быть обусловлены, как межвидовыми различиями строения твердых тканей конодонтов, так и недостаточной детальностью исследований ордовикских конодонтовых элементов. Полученные данные уточняют кристаллическое строение ископаемых остатков рода Polygnathus. Согласно полученным данным альбидная ткань является пористым монокристаллом и существенно более упорядочена, чем гиалиновая. Ранее считалось, что альбидная ткань хуже окристаллизована, чем гиалиновая. Гиалиновая ткань рассматривалась как гомолог эмали, а альбидная — кости и дентина. Проведенные исследования показывают, что структура альбидной ткани уникальна. Можно предположить, что она сформировалась еще при жизни конодонтов. В пользу этого говорит существование пористых монокристаллических твердых тканей у некоторых современных животных (например — кальцитные иглы морских ежей). Альтернативным механизмом образования монокристаллического материала мог быть процесс рекристаллизации поликристаллического вещества путем длительной фоссилизации под действием окружающей среды. Однако, этому противоречит тот факт, что альбидная ткань имеет одинаковую однородную струкутру как у вершин зубцов (контактирующих с окружающей средой), так и в их корневых частях (изолированных от окружающей среды слоями гиалиновой ткани). Поэтому, по нашему мнению, наиболее вероятно, что альбидная ткань конодонтового элемента, представляющая собой пористый монокристалл сформировалась непосредственно в живом организме в процессе биоминерализации in vivo.

4.2. Элементный и фазовый состав. Изоморфизм апатита.

Результаты рентгенои электронографии, дополненные данными элементного анализа и колебательной спектроскопии показали, что минеральная компонента всех тканей исследованных конодонтовых элементов конодонтов рода Polygnathus (отряд Ozarkodinida) представлена карбонагсо держащим апатитом-(СаР).

Результаты гистохимических исследований конодонтовых элементов, протравленных в присутствии Coomassie Blue (0.005%), указывают на то, что после растворения минерального вещества, органический остаток гиалиновой ткани содержит вещества белковой природы или продукты их разложения (синее окрашивание) (рис. 4.31). Ядра зубцов, состоящие из альбидной ткани, после растворения минеральной компоненты не дают специфической реакции на белковые соединения, что может быть обусловлено их малым количеством, или присутствием органического вещества небелковой природы.

Рис. 4.31. Последовательные стадии растворения конодонтового элемента в солянокислом растворе в присутствии Coomassie Blue (0.005%).

В целом, результаты проведенных нами гистохимических исследований тканей элементов конодонтов рода Polygnathus аналогичны данным, полученным для конодонтов других родов (Kemp, Nicoll, 1997; Donoghue, 1998; Kemp, 2002). Несомненно, такие исследования дают только общие представления о природе органического вещества и характере его распределения в твердых тканях конодонтового элемента. Для определения более точного состава органической матрицы элементов необходимо проводить дополнительные исследования (например ВЭЖХ, электрофорез и т. д.). Таким образом, наличие в исследованных нами конодонтовых элементах матрицы из органического вещества белковой природы, а также минеральной — апатита-(СаР) позволяет рассматривать их твердую ткань как апатит-(СаР)-органический композит.

На KP-спектрах, полученных от различных областей (тканей) среза конодонтового элемента (рис. 4.32), присутствуют характеристические полосы пропускания, соответствующие валентным и деформационным колебаниям связей [РО4]3″, [СО3]2″ ионов, а также фрагментов органических молекул. Колебаниям связей [Р04]3″ -ионов на KP-спектрах в выделенном диапазоне соответствуют полосы поглощения 964 cm" '(vi) — и 1030 см" 1 -1080 см" '(уз). На спектрах также присутствует слабая полоса, соответствующая колебаниям связей карбонат-иона B-типа при 1072 см" 1 (рис. 4.326). Отсутствие на KP-спектрах полосы 1107 cm" 1, являющейся характеристической для карбонат-иона А-типа, исключает присутствие карбонат ионов в каналах структуры апатита-(СаР) твердых тканей конодонтового элемента. Дополнительно на КР-спектрах присутствуют много широких полос, отвечающих вероятно колебаниям различных фрагментов органической составляющей тканей (или внешним загрязнениям). Так, в области около 1 ООО см" 1 могут быть полосы соответствующие колебаниям связей в С-Н, C-Ph, а также НРО4 «(в апатите). Другие широкие полосы, не относящиеся к колебаниям связей в апатите, могут быть идентифицированы следующим образом 1055 см'1 — С-С, 1090 см» 1 С-С, -NH2, 1190 см" 1 — C-Ph, NC2 (амин), 1280 см" 1 — амид III, С-ОН, 1384 см" 1 — СО2″, 1480 см'1 -СН2. По результатам профильного анализа КР-спектров в диапазоне 900 — 1125 см" 1 было установлено, что величина полуширины пиков на спектрах, соответствующих колебаниям связей [РО4] «иона, закономерно увеличиваются при последовательном переходе от тканей в области зубца (альбидная тканьточка 1 FWHM = 8.24 см» 1) к основанию зубца (альбидно-гиалиновая ткань — точка 2 FWHM = 8.5 см" 1) и затем к стержневой области (гиалиновая ткань — точка 3 FWHM = 8.9 см" 1) элемента (рис. 4.326). С учетом данных электронной микроскопии (раздел 4.1) наблюдаемая закономерность обусловлена, главным образом, уменьшением размеров кристаллитов апатита и увеличением их разороинетировки. Дополнительно, следует отметить, что в этом же направлении на КР-спектрах происходит увеличение относительной интенсивности полосы, соответствующей колебаниям связей карбонат-иона В-типа при 1072 см" 1, что говорит о незначительном увеличении его содержании. Сопоставляя интенсивности данной полосы на КР-спектрах твердых тканей конодонтовых.

1 § •3 Ш2* 1 •Ш к.

В * 2 В л ^ г.

Ч’Ц > щашГ.

ОМ.

0 32.

0 30.

0 2 В.

0.086.

0 078 .

0 074.

0 070.

0 120.

О 33 о ия о по.

0 31 О.

I™ '1.

900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600.

Сдвиг частот [см ].

ЗОО 950 1000 1050, 1100.

Сдвиг часГОГ [о* I.

Рис. 4.32. (а) Изображение конодонтового элемента с указанием областей, от которых были получены КР-спектры. (б) КР-спектры от областей (1−3) в диапазоне от 900 до 1600 см" 1 и выделенные области спектра (900−1125 см~!) с разделенными пиками. элементов и синтезированных нами карбонатсодержащих апатит-(СаР)-желатиновых композитов (рис.5н, раздел 5), можно сделать вывод, что содержание карбонат иона в апатите-(СаР) всех твердых тканей исследованных нами конодонтовых элементов не превышает 2 мас.%.

Наиболее детально нами был изучен апатит альбидной ткани зубца конодонтового элемента, который по данным ЭД и ВРПЭМ исследований ультратонких срезов (см. раздел 4.1) представляет собой особый тип мезокристаллических материалов -«пористый монокристалл». Полученные методом монокристалла значения параметров элементарной ячейки двух образцов (а = 9.374(2), 9.376(2) — с= 6.882(2), 6.892(1) А) очень близки между собой и к значениям, характерным для стехиометриичес кого апатита-(СаР) (а = 9.367(I), с = 6.884 (1) А, Биаагеапап еЛ. а!, 1972).

А Т ч.

0.1 mm.

Рис. 4.33. Зубец конодонтового Sспектроскопии элемента.

По результатам ЭДС элементный состав одного из этих образцов (рис. 4.33) (а = 9.374(2), с= 6.882(2) А): Са — 38.0(8) — Р — 18.6(7), F -2.5(3), Sr — 1.7(4), Na — 0.24(15), РЬ — 0.65(32), Sn — 0.42(32), С1 — 0.15(8), Si -0.13(03), Mg -0.03(5), К — 0.09(7) мас.%. Эти данные подтверждают, что альбидная ткань действительно сформирована апатитом-(СаР), содержащим небольшое количество примесей. Основываясь на результатах колебательной предположим, что в исследованном апатите содержится около 1 мас.% карбонат иона. Тогда рассчитанная, но данным ЭДС химическая формула апатита имеет вид:

Ca^jsSr o.isNao.m Sn0.03Pb0.03 К0.02 Mg o. oi о.4з)(Р04)5.79 (SiO^.os (C03)o.i6 (F1.27 Cl0. o4 (, H20, OH) o.69).

Таким образом, незначительное, но достоверное увеличение параметра, а исследоваиного апатита относительно стехиометрического (на 0.007, 0.009 А, что составляет ~4сг) можно объяснить частичным замещением ионов кальция на более крупные ионы стронция (гса=1−00 A, rSr=l.l8 A, Shannon, 1976). Нельзя также исключить аналогичное влияние замены части анионов фтора на гидроксильные группы или молекулы воды, о возможности такого замещения указывает выявленный по результатам ЭДС незначительный дефицит фтора (менее 3.8 мас.%, что соответствует 2 атомам на эл.яч.). Параметр с достоверно увеличен, только для одного образца (на 0.008А, что составляет ~4а). Отсутствие увеличения во втором образце можно объяснить противоположным влиянием на значение этого параметра вакансий в позиции кальция, величина которой по данным химического анализа этого образца, как показано выше составляет 0.4 на эл.яч.

Результаты уточнения кристаллической структуры «монокристалла» апатита альбидной ткани зубца (рис. 4.33) методом РСА показали, что координаты атомов, межатомные расстояния и валентные углы в кристаллических структурах исследованного нами апатита-(СаР) альбидной ткани и стехиометрического апатита-(СаР) очень близки (пр. [р. Рбз/m) (табл.4.1, 4.2).

8.

Заключение

.

С использованием широкого комплекса современных инструментальных методов проведено изучение кристаллохимии и морфогенезиса природных и биомиметических апатит-(СаР)-органических композитов.

1. Проведено изучение морфологии и нанокомпозитной структуры вещества твердых тканей S-элементов конодонтов рода Polygnathus (отряд Ozarkodinida) из девонских отложений вблизи озера Ильмень.

Показано, что вещество твердых тканей конодонтовых элементов является апатито-органическим нанокомпозитом, различающимся по степени разориентировки кристаллитов карбонатсодержащего апатита В-типа, содержанию органической компоненты и микроэлементов, а также размеру и распределению пор. Вещество альбидной и гиалиновой тканей представляет собой полностью или частично наноструктурированный материал (мезокристалл).

2. В условиях, имитирующих биологическую минерализацию в живых организмах, методом встречной диффузии в желатиновом геле синтезированы апатит-(СаР)-желатиновые композиты.

Показано, что по нанокомпозитной структуре, содержанию белковой компоненты и особенностям изоморфизма апатита биомиметические композиты являются аналогами вещества эмалеподобной ткани зубов некоторых современных рыб (акула и рыба-кабан), а если не учитывать переменное содержание органической компоненты и твердых тканей ископаемых организмов высокой степени фоссилизации. По содержанию органической составляющей, ионов карбоната и натрия в апатите, а также размерам кристаллитов синтезированные композиты близки к эмали зубов современных млекопитающих, в том числе человека.

3. Экспериментально изучен морфогенезис апатит-(СаР) — желатиновых композитов.

Показано, что формирование биомиметических апатит-(СаР)-желатиновых нанокомпозитов начинается с образования мозаичной структуры из нанопластинок апатита вдоль макромолекул желатина, проходит стадию сноповидных агрегатов (из удлиненных разориентированных композитных наноблоков) и затем гексагонально-призматических упорядоченных частиц (мезокристаллов). Параллельно идет формирование сверхструктуры нанокомпозита и его внутреннего электрического поля, дефицит кальция в апатите уменьшается. На следующей стадии начинается расщепление частиц, которое через серию гантелеобразных форм приводит к образованию сферолитов.

Проанализированы возможные механизмы расщепления агрегатов (за счет формирующихся в процессе роста агрегатов внутренних напряжений и электрического поля диполя).

4. Изучено влияние карбонат-иона на морфогенетические особенности, нанокомпозитную структуру и изоморфизм апатита синтезированных композитов.

Установлено, что с увеличением содержания в среде кристаллизации карбонат-ионов анизометрия формирующихся агрегатов уменьшается, призматические грани мезокристаллов замещаются округлыми поверхностями, характер расщепления частиц изменяется, разориентировка кристаллитов апатита увеличивается, их размеры вдоль направления [0001] уменьшаются.

Показано, что вхождение карбонат-иона в структуру апатита-(СаР) (за счет замещения фосфат-ионов) приводит к образованию трех серий твердых растворов, различающихся степенью нестехиометрии апатита и природой ее возникновения. По мере роста содержания в апатите карбонат-иона доля вакансий в позициях кальция и фтора увеличивается.

Полученные результаты выявляют неизвестные ранее особенности нанокомпозитной структуры вещества биологических твердых тканей и вносят существенный вклад в изучение процессов фосфатной биоминерализации.